周韻嬌，江慶玲，王喬

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系, 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032; 2. 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院, 四川 成都 610041

2019年12月，世界范圍內(nèi)發(fā)生了不明原因肺炎疫情。2020年1月7日，多方專家評估后證實(shí)此次疫情的病原為一種新型冠狀病毒[1-3]。2020年2月，國際病毒分類委員會將此種新型冠狀病毒命名為severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)[4]；同時，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)將SARS-CoV-2感染引起的肺炎命名為COVID-19。SARS-CoV-2已呈現(xiàn)向全球蔓延的趨勢，令中國和全世界都蒙受著巨大的損失并面臨極大的公共健康風(fēng)險(xiǎn)。目前尚無預(yù)防及治療的特效藥物，防控形勢極為嚴(yán)峻。

患者的治愈固然離不開藥物對病毒擴(kuò)增的抑制作用和對人體功能的促進(jìn)和維持作用，但更多的還是源于人體自身免疫系統(tǒng)對病毒的清除效力。本文簡要講述免疫系統(tǒng)抗擊并清除SARS-CoV-2的過程。同時免疫系統(tǒng)并非完美無缺，有時反而會引發(fā)負(fù)面反應(yīng)。在不少重癥患者的血漿中各類細(xì)胞因子的含量急劇飆升，引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過度和失控，并對機(jī)體的正常細(xì)胞造成傷害。這樣的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”與感染者的癥狀嚴(yán)重性密切相關(guān)，最終還可能導(dǎo)致患者死亡。另外，利用血漿療法治療重癥患者、制備疫苗來預(yù)防SARS-CoV-2感染等免疫相關(guān)的治療策略正受到廣泛期待。眾多研究小組都在通過不同的策略研究制備高效、安全的疫苗。然而通過疫苗接種來誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體真的能一帆風(fēng)順嗎？本文還將進(jìn)一步從免疫系統(tǒng)的角度討論疫苗制備過程中可能遇到的困難與挑戰(zhàn)。

1 免疫系統(tǒng)的正面抗擊

面對SARS-CoV-2的侵染，人體的免疫系統(tǒng)早已進(jìn)化出了一整套高效的免疫屏障和應(yīng)對手段，一方面能被動防止病毒的入侵，另一方面還能主動消滅已經(jīng)入侵的病毒(圖1)。

黏附在固體表面或空氣中飄浮的SARS-CoV-2會試圖通過各種渠道進(jìn)入人體內(nèi)。人體表面的皮膚能夠阻斷絕大部分SARS-CoV-2的入侵。這些黏附在皮膚表面的病毒并不能穿透表皮層，用水清洗皮膚(洗手、洗澡)更可以有效地將這些病毒沖走。

SARS-CoV-2最終找到渠道進(jìn)入呼吸系統(tǒng)，但并非代表一定就會引起感染。人體的鼻腔、咽喉、氣管及支氣管內(nèi)都能夠分泌大量黏液，這些黏液能夠黏附病毒，形成噴嚏或痰液并排出體外，從而抑制病毒感染肺部組織細(xì)胞。

少量的病毒可以被物理屏障阻斷于人體肺部之外，但當(dāng)人體受到較多量的病毒感染時，總有一小部分病毒會最終抵達(dá)肺部。與SARS-CoV一樣，SARS-CoV-2也是通過其表面刺突蛋白(spike protein，S蛋白)與肺部上皮細(xì)胞的受體蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(recombinant angiotensin I converting enzyme 2, ACE-2)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)侵染[2,5]。病毒表面S蛋白具有2種結(jié)構(gòu)構(gòu)象，融合前構(gòu)象(prefusion)和融合后構(gòu)象(postfusion)[6]。冠狀病毒感染細(xì)胞時，通過病毒表面S蛋白與ACE-2受體相結(jié)合形成復(fù)合物，并通過質(zhì)膜內(nèi)陷形成內(nèi)吞體包裹病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒經(jīng)內(nèi)吞作用(endocytosis)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體后，其表面S蛋白會被溶酶體內(nèi)的蛋白酶切割并誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從融合前構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)槿诤虾髽?gòu)象。這些變化促進(jìn)了病毒顆粒與宿主細(xì)胞的膜融合，從而釋放病毒基因組至細(xì)胞質(zhì)，最終完成侵染過程。

病毒侵染細(xì)胞后，機(jī)體的固有免疫(innate immunity)系統(tǒng)會啟動各項(xiàng)機(jī)制進(jìn)行對抗。被病毒感染的細(xì)胞本身就具有一系列抗病毒機(jī)制：其胞內(nèi)蛋白元件檢測到病毒RNA后，各類抗病毒蛋白通過信號通路被激活表達(dá)。這些抗病毒蛋白能夠?qū)Σ《驹诎麅?nèi)的復(fù)制、合成、裝配、分泌等各個步驟起到抑制作用。同時，細(xì)胞因子(cytokine)，包括各類干擾素(interferon, IFN)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、淋巴因子(lymphokine)等也被激活表達(dá)。它們是分子量較小的蛋白質(zhì)，由細(xì)胞合成并分泌到胞外，廣泛參與細(xì)胞間的信號傳遞，并將此處發(fā)生病毒感染的信息傳遞出去。各類細(xì)胞因子能夠招募多種免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞(macrophage)、樹突細(xì)胞(dendritic cell)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell)等。這些免疫細(xì)胞參與了一系列的生理過程，包括對病毒顆粒的吞噬和降解、釋放更多的細(xì)胞因子以促進(jìn)炎癥反應(yīng)、清除被病毒感染的細(xì)胞等。

與此同時，適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)系統(tǒng)在消滅病毒的過程中起著尤為重要的核心作用(圖1)。當(dāng)機(jī)體被病毒感染后，游離在全身各處的成熟B細(xì)胞(na?ve B cell)有可能與病毒顆粒相遇。當(dāng)B細(xì)胞中由V、D和J基因片段重排產(chǎn)生的抗體(antibody)天然性地識別病毒顆粒時，B細(xì)胞會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)闈{母細(xì)胞(plasmablast)并開始大量分泌IgM。這類抗體屬于早期產(chǎn)生的抗體，雖然其抗原特異性較低，但在一定程度上也能參與遏制病毒的擴(kuò)增，為機(jī)體產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的高效中和抗體贏得時間。除了變?yōu)闈{母細(xì)胞外，一部分能夠識別病毒顆粒的B細(xì)胞還會進(jìn)入淋巴小結(jié)中，與受到病毒激活的輔助性T細(xì)胞形成生發(fā)中心(germinal center)。這些B細(xì)胞的抗體會在此處進(jìn)一步突變和篩選，最終進(jìn)化出特異性識別病毒顆粒的高效中和抗體。突變出高效中和抗體的B細(xì)胞會轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞(plasma cell)，并移至骨髓，分泌大量IgG型抗體。由于經(jīng)歷過多輪篩選和突變，這些新生成的抗體對病毒顆粒有非常高的特異性和中和效力。它們通過體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)被感染的部位，不僅能結(jié)合病毒以阻止其進(jìn)一步對細(xì)胞的感染，還能進(jìn)一步促進(jìn)免疫細(xì)胞對病毒的吞噬及通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)直接殺傷被病毒感染的靶細(xì)胞。

從物理屏障到細(xì)胞因子介導(dǎo)的固有免疫，從固有免疫到產(chǎn)生具有記憶性的適應(yīng)性免疫，人體免疫系統(tǒng)進(jìn)化出了一系列全方位、高精準(zhǔn)的抗病毒機(jī)制，保證了人體在對抗SARS-CoV-2的戰(zhàn)斗中能大概率取勝。

2 “細(xì)胞因子風(fēng)暴”的負(fù)面作用

目前，SARS-CoV-2感染致死的患者以老年人居多，究其原因主要還是因?yàn)槔夏耆吮旧淼拿庖吡^差，不足以遏制病毒的擴(kuò)增。同時，部分老年人還合并一些基礎(chǔ)疾病，感染SARS-CoV-2后，身體功能的下降又加重了本身的基礎(chǔ)疾病，最終導(dǎo)致器官衰竭。

然而，還有一些年輕的患者被SARS-CoV-2感染后，初期肺炎癥狀表現(xiàn)較輕，中、后期病情會突然惡化，急轉(zhuǎn)直下。這些患者出現(xiàn)呼吸困難，并發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[7]。同時，患者還會呈現(xiàn)凝血功能障礙、內(nèi)臟器官衰竭等一系列極為致命的癥狀。

這些病情急轉(zhuǎn)直下的患者是因?yàn)槠潴w內(nèi)產(chǎn)生了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，也稱“炎癥風(fēng)暴”。上述提到，細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子能招募更多的免疫細(xì)胞，促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制病毒的擴(kuò)增并清除病毒顆粒(圖1)。然而當(dāng)機(jī)體免疫應(yīng)答激活太久或太強(qiáng)時，有可能促發(fā)細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)過度及失控的炎癥反應(yīng)，這就是“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。比如，SARS-CoV感染可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ[8]，同時血液中其他的促炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IFN-γ inducible protein-10, IP-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白 1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)等的水平也會急劇增高，其表達(dá)水平與患者肺部損傷的程度密切相關(guān)[9]。在中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)冠狀病毒感染的患者中，也同樣檢測到IFN-γ、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-15、 IL-17等細(xì)胞因子在血液中的升高[10]。在H7N9流感病毒感染的急性患者血液中，IP-10、IFN-γ誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子(monokine induced by IFN-γ, MIG)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白 1β(macrophage inflammatory protein 1β, MIP-1β)、MCP-1、IL-6、IL-8、IFN-α等細(xì)胞因子升高趨勢也非常明顯[11]。而在此次SARS-CoV-2感染的患者血液中同樣檢測到大量的IL-1β、IFN-γ、IP-10、MCP-1等細(xì)胞因子[12]。與一般病房中的患者相比，重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)中的患者具有更高濃度的細(xì)胞因子水平(G-CSF，IP-10，MCP-1，MIP-1A和TNF-α)[12]。上述數(shù)據(jù)都進(jìn)一步表明“細(xì)胞因子風(fēng)暴”對SARS-CoV-2感染患者的病程具有負(fù)面作用。

正是因?yàn)椤凹?xì)胞因子風(fēng)暴”可能帶來的負(fù)面效應(yīng)，在臨床治療中采取利用細(xì)胞因子促進(jìn)免疫應(yīng)答的治療方案時，需特別慎重。比如，IFN在病毒感染的早期可能發(fā)揮抗病毒作用，但在感染后期使用，則極有可能對“細(xì)胞因子風(fēng)暴”推波助瀾，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

探索降低“細(xì)胞因子風(fēng)暴”負(fù)面影響的有效方案已成為臨床上研究的熱點(diǎn)。這樣的策略雖然減緩了機(jī)體對病毒的清除，但能極大延長患者的生存時間，為其最終康復(fù)取得時機(jī)。人們開始嘗試?yán)酶黝惣?xì)胞因子的特異性抗體來中和其促炎癥作用。雖然應(yīng)用抗TNF和抗IL-1抗體的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)并沒有降低接受治療患者的病死率，但抗IL-6抗體則可能減緩“細(xì)胞因子風(fēng)暴”導(dǎo)致的器官衰竭。另外，近年來，不同研究小組和公司也在致力于開發(fā)用于降低體內(nèi)細(xì)胞因子水平的新技術(shù)、新方法。比如，CytoSorb療法可利用特殊材料吸收血液中游離的細(xì)胞因子，從而降低過量的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[13, 14]。而間接抑制固有免疫系統(tǒng)中的補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)也有可能被廣泛應(yīng)用于臨床，從而下調(diào)過度激活的免疫系統(tǒng)[15]。

3 抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)可能對免疫治療造成挑戰(zhàn)

疫情的惡化促使成千上萬的醫(yī)學(xué)科研工作者投入藥物治療和預(yù)防的研發(fā)中。研發(fā)免疫相關(guān)的治療手段無疑是其中的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)在，有些醫(yī)院開始嘗試使用傳統(tǒng)的血漿療法，鼓勵曾經(jīng)感染但已恢復(fù)的患者獻(xiàn)出血漿用于治療重癥患者。然而，血漿療法具有不安全、效果不穩(wěn)定、成本高、獲取量較小等一系列缺點(diǎn)。因此，研發(fā)安全、有效的疫苗接種未感染人群，才是長治久安之道。

不論是血漿治療，還是疫苗防護(hù)，這些方法都基于一個假設(shè)，即人體能夠產(chǎn)生特異性識別病毒顆粒并具有中和效力的抗體?？祻?fù)者的血漿為什么被認(rèn)為可以用來治愈重癥患者，主要就是因?yàn)樗麄凅w內(nèi)曾經(jīng)感染過病毒，其適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞有可能進(jìn)化篩選出能高效、特異結(jié)合病毒顆粒的抗體。而疫苗接種為什么可以保護(hù)未感染人群，就是因?yàn)槿梭w接種疫苗后，模擬了病毒感染，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，最終生成具有保護(hù)力的抗體。

最近的報(bào)道顯示，急性感染的患者能夠產(chǎn)生針對SARS-CoV-2核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)的IgM、IgG抗體[16]。而之前關(guān)于SARS-CoV感染患者的研究也顯示人體能夠產(chǎn)生針對N蛋白和S蛋白的抗體[17]，且此抗體能持續(xù)較長時間[18]。不同科研小組也篩選到針對SARS-CoV表面S蛋白的抗體S230、80R、m396以及 F26G19，抗體CR3022[19]最近還被證實(shí)能與SARS-CoV-2表面蛋白的受體結(jié)合區(qū)域(receptor-binding domain)發(fā)生交叉反應(yīng)[20]。這些結(jié)果都表明人體能產(chǎn)生針對SARS-CoV-2的抗體。

人體感染冠狀病毒后，免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生各種各樣針對病毒顆粒及其組分的特異性抗體。在這些抗體中，只有針對病毒表面S蛋白的抗體能夠結(jié)合病毒顆粒；而那些針對病毒其他元件和組分的抗體并不能與病毒顆粒發(fā)生結(jié)合，這是因?yàn)檫@些組分被包裹在病毒內(nèi)部，抗體無法與其接觸。這些結(jié)合病毒表面S蛋白的抗體各式各樣，它們在S蛋白上分別具有不同的結(jié)合位點(diǎn)。可以想象的是，其中有一部分抗體，其結(jié)合位點(diǎn)恰恰與病毒表面S蛋白上細(xì)胞受體的結(jié)合部位重合。這類抗體不僅能結(jié)合病毒顆粒，還能夠與細(xì)胞表面受體競爭性地結(jié)合病毒顆粒。若抗體的結(jié)合力夠強(qiáng)，這類抗體就能阻止病毒表面蛋白與細(xì)胞受體的結(jié)合，從而抑制病毒感染，我們稱這類抗體為中和抗體(neutralizing antibody)。而另外大部分能結(jié)合病毒顆粒，卻不具備體外中和效力的抗體，在人體內(nèi)也能通過其恒定區(qū)的Fc區(qū)域起到非常重要的作用?？贵w的Fc區(qū)域可以通過結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體，招募各類效應(yīng)細(xì)胞：招募自然殺傷細(xì)胞，引發(fā)ADCC；招募結(jié)合血清中的補(bǔ)體分子，誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity, CDC)；招募巨噬細(xì)胞，引發(fā)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)。綜上所述，這些依賴或不依賴Fc區(qū)域的功能，都使抗體在病毒清除過程中起著舉足輕重的作用，也使人們憧憬著安全、高效的疫苗可以誘導(dǎo)出廣譜、高效的中和抗體。

然而，開發(fā)疫苗并非如此簡單。以登革病毒(Dengue virus)為例。登革病毒有4類血清型，而人體在感染某個血清型的登革病毒后，機(jī)體能產(chǎn)生針對該血清型的具有終身保護(hù)效力的抗體[21]。但是有趣的是，登革病毒導(dǎo)致威脅生命的登革出血熱癥狀并非發(fā)生在第1次感染[22]，而往往發(fā)生在第2次感染不同血清類型病毒之后(氨基酸序列差異為30%～35%)。究其原因，是因?yàn)榈?次感染后誘導(dǎo)產(chǎn)生針對某一血清型登革病毒的抗體，其濃度或親和力不足以中和第2次感染中另一血清型的病毒，反而促進(jìn)病毒感染增強(qiáng)。這種現(xiàn)象被稱為抗體依賴的增強(qiáng)效應(yīng)(antibody-dependent enhancement effect，ADE效應(yīng))。ADE效應(yīng)在登革病毒、黃熱病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒、人類免疫缺陷病毒等感染中都廣泛存在[23,24]。

在ADE效應(yīng)發(fā)生時，結(jié)合病毒顆粒的抗體，通過其Fc區(qū)域使病毒顆粒被擁有Fc受體或補(bǔ)體受體的細(xì)胞吞噬，反而促進(jìn)其對這類細(xì)胞的侵染。正如前文所述，某些種類的病毒感染細(xì)胞時，病毒顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞體內(nèi)，在溶酶體中完成病毒膜與宿主膜的融合過程。而依賴于抗體的內(nèi)吞作用反而促進(jìn)了病毒顆粒被宿主細(xì)胞所吞噬，加重病毒感染。因此，抗體是否抑制或促進(jìn)病毒感染，是其中和效力與ADE效應(yīng)共同平衡的結(jié)果；而血清對病毒的影響則是其中所包含的所有抗體分子(中和效力與ADE效應(yīng))的綜合表現(xiàn)。

正是因?yàn)锳DE效應(yīng)的存在，針對登革病毒(1960年發(fā)現(xiàn))的疫苗一直沒有研發(fā)成功。直到2019年首個登革熱疫苗才被批準(zhǔn)上市。即使有了疫苗，這款疫苗也只可用于那些曾經(jīng)感染過登革病毒的人，且接種前必須接受一系列檢查和測試，否則接種該疫苗反而有可能加重未來感染登革病毒后的癥狀。這些限制也都是由于擔(dān)心感染不同血清型的登革病毒可能發(fā)生ADE效應(yīng)而設(shè)置的。

現(xiàn)在，尚沒有數(shù)據(jù)顯示針對SARS-CoV-2的抗體也具有ADE效應(yīng)。但近年來一些關(guān)于SARS-CoV抗體的研究支持這一可能性。有研究表明，曾經(jīng)感染過SARS-CoV的康復(fù)者血清被稀釋后具有一定的促進(jìn)病毒感染增強(qiáng)的作用[25]。這些增強(qiáng)作用被證實(shí)是來源于針對S蛋白的抗體，而非N蛋白的抗體[25,26]。進(jìn)一步的研究證實(shí)，針對SARS-CoV表面S蛋白的單克隆抗體具有ADE效應(yīng)[25]。

當(dāng)前，全球范圍內(nèi)尚沒有針對SARS(2003年發(fā)現(xiàn))或MERS-CoV(2012年發(fā)現(xiàn))的疫苗獲準(zhǔn)接種人群?？茖W(xué)家們?yōu)榇苏归_了眾多臨床前動物實(shí)驗(yàn)。雖然在猴子中的SARS疫苗[27,28]和MERS疫苗[29,30]免疫方案較為成功地起到了保護(hù)作用，但是在雪貂中的疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明，SARS疫苗并沒有預(yù)防SARS-CoV感染，反而在肝組織造成嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和局部壞死[31,32]。而在倉鼠和小鼠中的疫苗實(shí)驗(yàn)也顯示免疫后血清呈現(xiàn)ADE效應(yīng)[26,33]。

更進(jìn)一步分析，即使疫苗能夠起到對該種病毒的防護(hù)作用，但在受到不同亞型病毒或相似的冠狀病毒感染時，是否也能起到保護(hù)作用而不會發(fā)生ADE效應(yīng)呢？這就類似于感染了某一血清型的登革病毒的人群，當(dāng)再次感染其他血清型登革病毒時，其癥狀會更為嚴(yán)重。這也類似于接種了登革熱疫苗的人群，當(dāng)其感染寨卡病毒時反而可能出現(xiàn)更為劇烈的病毒復(fù)制和感染癥狀[34]。

顯而易見，為回答“SARS-CoV-2疫苗是否有可能導(dǎo)致不同突變型或其他冠狀病毒的感染加重”這個問題，科學(xué)家們還需要充分考慮到抗體的ADE效應(yīng)以及病毒的變異等諸多問題，在細(xì)胞水平和動物模型中完成更廣泛、更深入的實(shí)驗(yàn)，尋找選擇更為合理、安全的蛋白抗原，設(shè)置更為有效的疫苗接種策略。

4 結(jié)語

在抗疫工作中，人類面對的客觀世界是無限的，而人類對自然界的探索和認(rèn)知也必然是無止境的。在這場抗擊疫情的斗爭中，科研工作者們必須充分認(rèn)識到機(jī)體免疫系統(tǒng)與SARS-CoV-2的密切關(guān)系，深入了解免疫系統(tǒng)在感染過程中的利與弊，積極借鑒其他病毒的防治策略。只有這樣，人們才能未雨綢繆，采取更安全的應(yīng)對措施，運(yùn)籌帷幄，制定出更有效的預(yù)防和治療策略。