艾奎 邊俊梅 李楨

[摘要] 目的 探討神曲消食口服液治療兒童消化不良的機制。 方法 采用鹽酸林可霉素灌胃C57小鼠進行小鼠消化不良造模，灌胃給藥“媽咪愛”或神曲消食口服液進行治療，正常組灌胃等體積的無菌生理鹽水。利用16S rDNA高通量測序技術，檢測各組小鼠腸道菌群多樣性變化。 結果 與空白組相比，模型組小鼠體重顯著降低（P<0.05）。高通量測序結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠腸道微生物多樣性指數降低（Shannon指數，P>0.05），在門和屬的水平上，腸道微生物多樣性均降低。經神曲消食口服液治療后，小鼠體重明顯增加（P<0.05），腸道微生物多樣性指數升高（Shannon指數，P>0.05），腸道微生物多樣性增加。在門的水平上，硬壁菌門（Firmicutes）豐度增加（P>0.05），變形菌門（Proteobacteria）豐度降低（P>0.05）。在屬的水平上，小鼠腸道內益生菌乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的豐度增加（P>0.05），有害菌巴氏桿菌屬（Pasteurella）的豐度顯著降低（P<0.05）。 結論 采用神曲消食口服液治療能增加小鼠腸道菌群多樣性，恢復小鼠腸道微生態(tài)平衡。神曲消食口服液治療兒童消化不良可能與腸道乳酸桿菌增加有關。

[關鍵詞] 消化不良;腸道微生物;菌群失調;乳酸桿菌

[中圖分類號] R725.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）22-0037-04

Animal study on the effect of Shenqu Xiaoshi oral liquid on intestinal microecology

AI Kui? ?BIAN Junmei? ?LI Zhen

Department of Pediatrics， Wuhan Third Hospital， Wuhan? ?430074， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Shenqu Xiaoshi oral liquid in the treatment of pediatric dyspepsia. Methods C57 mice were intragastrically administered with lincomycin hydrochloride for the modeling of dyspepsia. Medilac-vita or Shenqu Xiaoshi oral liquid was intragastrically administered for treatment. The normal group was intragastrically administered with equal volume of sterile saline. 16S rDNA high-throughput sequencing technology was used to detect the diversity changes of intestinal microflora in each group of mice. Results Compared with the blank group， the body weight of mice in the model group was significantly reduced（P<0.05）. High-throughput sequencing results showed that the intestinal microbial diversity index in the model group decreased compared with the blank group（Shannon index， P>0.05）. At the level of phylum and genus， intestinal microbial diversity decreased. After being treated with Shenqu Xiaoshi oral liquid， the body weight of mice increased significantly（P<0.05）， intestinal microbial diversity index increased（Shannon index， P>0.05）， and the intestinal microbial diversity increased. At the phylum level， the abundance of Firmicutes increased（P>0.05）， and the abundance of Proteobacteria decreased（P>0.05）. At the genus level， the abundance of the probiotic Lactobacillus in the intestine of mice increased（P>0.05）， and the abundance of harmful bacteria Pasteurella was significantly reduced（P<0.05）. Conclusion Shenqu Xiaoshi oral liquid can increase the diversity of intestinal flora in mice and restore the intestinal micro-ecological balance in mice. Shenqu Xiaoshi oral liquid in the treatment of pediatric dyspepsia may be related to the increase of intestinal Lactobacillus.

[Key words] Dyspepsia; Intestinal microflora; Flora disorder; Lactobacillus

功能性消化不良是兒科中普遍存在的一種消化系統(tǒng)疾病，臨床上常見的異常癥狀是胃排空延遲，胃竇動力不足、胃功能紊亂等[1]。神曲消食口服液是一種純中藥制劑，臨床研究表明，神曲消食口服液在治療兒童功能性消化不良、兒童厭食癥方面效果良好[2-4]，但其具體作用機制目前尚不明確。腸道微生物菌群的平衡失調與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關，腸道微生物穩(wěn)態(tài)在機體代謝、抗炎、抗癌、免疫調節(jié)等方面起著關鍵作用[5-7]。其中益生菌是一類有益于機體健康的微生物[8]。本實驗采用灌胃鹽酸林可霉素制備消化不良模型小鼠，采用灌胃“媽咪愛”和鹽酸林可霉素作為陽性對照組，利用腸道微生物16S rDNA測序技術，檢測消化不良的小鼠經神曲消食口服液治療前后腸道微生物種類和數量的變化情況。結果發(fā)現，與治療前相比，治療后小鼠體重增加，腸道內的微生物多樣性顯著上升。在屬的水平上進行分析，結果顯示，益生菌乳酸桿菌屬的含量顯著上調，這為進一步探討神曲消食口服液治療小兒消化不良的機制奠定了基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

4～8周齡[生長期，體重（20±2）g]雄性清潔級C57小鼠24只，購自北京中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所[動物許可證編號SCXK（鄂）2015-0018]，神曲消食口服液（國藥準字Z20153035）由揚子江藥業(yè)集團有限公司生產，枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒（“媽咪愛”，國藥準字S20020037）由北京韓美藥品有限公司生產，鹽酸林可霉素（國藥準字H41021052）由遂成藥業(yè)股份有限公司生產，高脂飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組? 24只C57小鼠空白組適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分成4組，每組6只。分別是空白組（生理鹽水灌胃）模型組（生理鹽水和鹽酸林可霉素灌胃）、陽性對照組（“媽咪愛”和鹽酸林可霉素灌胃）和治療組（神曲消食口服液和鹽酸林可霉素灌胃）。

1.2.2 造模? 參考Ma Qingjie等[9]的造模方法，所有分組的小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，A組采用無菌生理鹽水灌胃，與此同時B、C、D組均采用鹽酸林可霉素連續(xù)灌胃6 d，當出現糞便稀釋即消化不良模型造模成功。之后C、D組分別同時灌胃“媽咪愛”或神曲消食口服液，每天2次，連續(xù)6 d，A、B組灌胃等體積無菌生理鹽水，停止治療后繼續(xù)觀察2 d，實驗結束。

1.2.3 給藥劑量? “媽咪愛”的劑量為910 mg/kg，神曲消食口服液的劑量為每只每次1.6 mL，鹽酸林可霉素的劑量為2 g/kg。

1.2.4 腸道內容物提取? 實驗結束后，采用頸椎致死法處死小鼠，于超凈工作臺上無菌采集各小鼠空腸到回腸段內容物，置于無菌、冰盒預冷的離心管中，然后迅速置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 樣品預處理? 參照文獻[10]的處理方法，分別取各組一定量內容物于無菌離心管中進行預處理，備用。

1.2.6 腸道菌群宏基因組的提取? 參照文獻[10-11]的提取方法進行腸道菌群宏基因組的提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 16S rDNA高通量測序? 采用Miseq測序平臺對腸道內容物進行高通量測序，利用overlap將雙端數據進行拼接，并進行質控、嵌合體過濾，得到高質量的有效數據。最后進行多樣性分析等。

1.3 觀察指標

1.3.1 各組小鼠一般情況變化? 觀察小鼠被毛光澤度、精神狀態(tài)、食欲、大便性狀以及活動等情況變化;稱量并記錄小鼠體重，分析造模前后和治療前后（“治療后”統(tǒng)一指停止治療并繼續(xù)觀察2 d后，即實驗結束后）小鼠體重變化。

1.3.2 各組小鼠腸道菌群多樣性結果? 通過Shannon和Simpson指數分析造模前后和治療前后小鼠腸道微生物多樣性變化;通過Chao1和Observed species指數分析造模前后和治療前后小鼠腸道微生物數目（即豐度）變化。

1.3.3 各組小鼠腸道菌群成分分析? 分析治療前后小鼠腸道菌群成分變化，如門水平硬壁菌門和變形菌門豐度變化，以及屬水平乳酸桿菌屬和巴氏桿菌屬豐度變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

1.4.1 統(tǒng)計學分析? 計量資料以（x±s）表示。組間顯著性差異分析采用單因素ANOVA Turkey檢驗和t檢驗，其中P<0.05表示具有差異;P<0.01表示具有顯著性差異;P<0.001表示差異極顯著。

1.4.2 物種多樣性分析? 用Observed species， Chao1， Shannon， Simpson四個指數分析腸道中微生物多樣性，Shannon指數H'=-。Simpson指數：1-。Chao1指數S1=Sobs+.其中S代表總OTU數目，pi代表樣品中屬于第i個OTU的序列比例，S1代表估計的總OTU數目，Sobs代表實際測到的總OTU數目，F1代表只含有1條序列的OTU數目，F2代表只含有2條序列的OTU數目。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況變化

造模期間，空白組小鼠被毛密且有光澤，兩眼有神，較為活躍，食欲較好，體重逐漸增加，大便呈顆粒狀，耳色及尾色淡紅。模型組小鼠出現食欲減退，體重減輕，無神，被毛無光澤、疏松并易脫落，拱背，喜扎堆，活動緩慢，部分出現便溏，肛周糞便污染。造模成功后，各組給予對應處置及治療，陽性對照組和治療組小鼠上述癥狀和體征逐漸改善、消失。

表1顯示，造模前，與空白組相比，各組小鼠體重均無顯著性差異;造模成功后，進行藥物治療前，與空白組相比，模型組小鼠體重顯著降低[（38.89±0.29）g vs. （34.07±0.18）g，t=11.6001，P=0.0000];給予藥物治療后，與模型組比較，神曲消食口服液治療能顯著增加小鼠體重[（38.17±0.19）g vs. （40.94±0.26）g，t=3.8272，P=0.0001]。

2.2 各組小鼠腸道菌群多樣性結果

Alpha多樣性（Alpha_diversity）是指某個特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，主要用來反映物種豐富度和均勻度以及測序深度[12]。選取4個常用的Alpha多樣性指數-Shannon、Simpson、Chao1和Observed species進行分析，其中Shannon指數和Simpson指數用來描述物種多樣性，二者的數值越高，表明物種多樣性越高;Chao1指數和Observed species指數用來描述物種數目，數值越大，微生物種類越多。由表2可知，與空白組相比，模型組小鼠Observed species指數，Chao1指數，Shannon指數和Simpson指數均降低，表明模型組小鼠腸道微生物的豐度和多樣性均降低。經灌胃“媽咪愛”或神曲消食口服液后，各項指數值均有所增加，表明小鼠腸道微生物多樣性和豐度均有所恢復，其中灌胃“媽咪愛”組小鼠腸道微生物多樣性優(yōu)于空白對照組，灌胃神曲消食口服液組小鼠微生物多樣性略低于空白對照組，但優(yōu)于模型組。

2.3 各組小鼠腸道菌群成分分析

通過16S rDNA高通量測序對小鼠腸道內容物進行檢測，結果顯示，正常C57小鼠的腸道菌群主要為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（封三圖1顯示，blank：空白組;control：陽性對照組;model：模型組;treat：治療組）。經鹽酸林可霉素灌胃后小鼠的腸道菌群結構發(fā)生顯著變化，在門水平上表現為硬壁菌門豐度和變形菌門豐度增加，擬桿菌門豐度降低，微生物多樣性降低。經“媽咪愛”治療后，硬壁菌門豐度和變形菌門豐度降低，擬桿菌門豐度和疣微菌門豐度增加，同時放線菌屬（Actinobacteria）豐度增加，微生物多樣性增加。經神曲消食口服液治療后，硬壁菌門豐度增加（54.59% vs. 78.88%，χ2=48.894，P=0.60），變形菌門豐度降低（41.57% vs. 18.81%，χ2=56.704，P=0.60）。

在屬（genus）水平上對各組小鼠腸道菌群的變化進行分析（封三圖2顯示，blank：空白組;control：陽性對照組;model：模型組;treat：治療組），結果顯示，與模型組小鼠相比，“媽咪愛”治療組和神曲消食口服液治療組小鼠腸道菌群多樣性上升。其中神曲消食口服液治療組小鼠腸道內益生菌乳酸桿菌屬（Lactobacillus）豐度增加（41.42% vs. 47.29%，χ2=17.2447，P=0.8117），有害菌屬巴氏桿菌屬（Pasteurella）的豐度顯著降低（29.03% vs. 4.25%，χ2=15.364，P=0.0040）。

3 討論

多項臨床研究表明，神曲消食口服液治療消化不良療效良好，但其作用機制目前尚不清楚。胃腸道是宿主免疫系統(tǒng)和微生物之間相互作用的主要場所，胃腸道微生物菌群的紊亂與胃腸道疾病如腸炎、腹瀉等密切相關[13]。本研究旨在探討神曲消食口服液治療小兒消化不良的療效與腸道微生物菌群之間的關系，為闡明神曲消食口服液治療小兒消化不良的機制提供理論依據。

3.1 神曲消食口服液治療小兒消化不良與腸道菌群多樣性有關

腸道菌群的多樣性與胃腸道健康密切相關。有研究報道，對豬感染流行性腹瀉后的腸道微生物進行分析，結果顯示，在門水平上，厚壁菌門，擬桿菌門和變形菌門的數量均顯著降低，而梭桿菌門數量顯著增加[14]。擬桿菌是動物胃腸道中最常見的微生物之一[15，16]。它們的代謝主要基于食物和黏液糖蛋白的降解，而這些物質在免疫系統(tǒng)調節(jié)中起著重要作用[17]。使用抗生素構建的小鼠腹瀉模型中腸道菌群穩(wěn)態(tài)被破壞，微生物多樣性顯著降低[18]。過敏性腸綜合征（IBS）患者和健康受試者的糞便微生物組報告的薈萃分析結果顯示，乳酸桿菌和雙歧桿菌在腹瀉型IBS患者中顯著下調[19]。Alpha多樣性指數即Shannon、Simpson、Chao1和Observed species指數分析結果顯示，在門和屬的水平上，“媽咪愛”和神曲消食口服液治療后，小鼠腸道微生物多樣性均有所增加，益生菌乳酸桿菌屬豐度增加;“媽咪愛”治療組腸道微生物多樣性優(yōu)于神曲消食口服液治療組，但優(yōu)勢菌群乳酸桿菌屬在神曲消食口服液治療組豐度最高。因此，神曲消食口服液治療可能通過恢復腸道微生物的多樣性治療小兒消化不良，上述分析數據為進一步探討神曲消食口服液治療小兒消化不良的機制奠定了基礎。

3.2 神曲消食口服液治療小兒消化不良與乳酸桿菌增加有關

乳桿菌屬作為腸道菌群的次要成員，雖然數量少，但這些細菌的比例與人類疾病和慢性病癥密切相關[20]。Li J等[21]通過肝細胞小鼠模型發(fā)現，新型益生菌混合物Prohep可顯著減緩腫瘤生長。Ohtsu T等[22]的研究表明，益生菌加氏乳桿菌OLL2716可通過抑制幽門螺桿菌的作用改善幽門螺桿菌相關的消化不良。Muresan IAP等[23]發(fā)現羅伊氏乳桿菌與泮托拉唑聯(lián)合可以根除幽門螺旋桿菌。在肥胖患者中厚壁細菌，尤其是乳桿菌屬的比例增加[21]。乳酸桿菌與肥胖密切相關，乳酸桿菌通過參與宿主消化作用，影響宿主體重[24]。有研究顯示[25]，與未感染幽門螺桿菌的難民兒童相比，感染兒童形體上更加消瘦。Koga Y等[26]發(fā)現嗜酸乳桿菌LG21有望通過糾正胃內菌群失調改善功能性消化不良。小鼠體重記錄顯示，與模型組小鼠相比，神曲消食口服液治療組小鼠體重增加;16S rDNA高通量測序分析結果顯示，與模型組小鼠相比，神曲消食口服液治療組小鼠腸道益生菌乳酸桿菌數量增加，有害菌巴氏桿菌數量減少。神曲消食口服液治療可能通過增加乳酸桿菌數量，加速腸道蠕動，促進機體對營養(yǎng)物質的吸收，維護機體健康。

3.3 結語和展望

本研究通過16s rDNA高通量測序技術，分別對空白組、模型組、陽性對照組和神曲消食口服液治療組小鼠腸道內容物進行檢測分析，結果顯示，神曲消食口服液治療增加小鼠腸道菌群多樣性，恢復小鼠腸道微生態(tài)平衡，維護機體健康。在屬的水平上，神曲消食口服液治療顯著增加小鼠腸道內益生菌乳酸桿菌屬數量，進而促進腸道蠕動，增加體重，治療小兒消化不良。腸道微環(huán)境是一個復雜而又龐大的系統(tǒng)，需要從更廣闊的角度探究神曲消食口服液治療小兒消化不良的機制。

[參考文獻]

[1] Meenakshi G，Samuel N. Functional dyspepsia in children[J].Pediatric Annals，2014，43（4）：e101-e105.

[2] 趙繼紅.神曲消食口服液治療兒童功能性消化不良的臨床研究[J].世界最新醫(yī)學信息文摘，2018，18（65）：123-125.

[3] 李冉，孟憲珍，孫艷紅.神曲消食口服液聯(lián)合推拿療法治療小兒厭食脾失健運證的臨床療效[J].西南醫(yī)科大學學報，2019，42（1）：77-80.

[4] 吳曉燕，宋瑩瑩，成斌.神曲消食口服液配合五維賴氨酸治療厭食癥的療效觀察[J].中醫(yī)藥導報，2017，23（23）：107-110.

[5] Liao X，Song L，Zeng B，et al.Alteration of gut microbiota induced by DPP-4i treatment improves glucose homeostasis[J].EBio Medicine，2019，44：665-674.

[6] Vaiserman AM，Koliada AK，Marotta F.Gut microbiota：A player in aging and a target for anti-aging intervention[J].Ageing Research Reviews，2017，35：36-45.

[7] Kang C，Wang B，Kaliannan K，et al.Gut microbiota mediates the protective effects of dietary capsaicin against chronic low-grade inflammation and associated obesity induced by high-fat diet[J].MBio，2017，8（3）：e00470-477.

[8] Gupta S，Fekaninová A，Lokesh J，et al.Lactobacillus dominate in the intestine of Atlantic salmon fed dietary probiotics[J].Frontiers in Microbiology，2019，9：3247.

[9] Ma Qiongjie，Ding Jie，Zhao Hai，et al. Effects of egg white polypeptides immunized by Rotavirus on the constitution of dyspepsia mice et al[J]. Journal of Anhui Agri Sci，2013，41（34）：13250-13252.

[10] Zhang QL，Peng XX，Wu H，et al. Molecular diversity of intestinal microbiota in dysbacteria diarrheal mice associated with ultra-micro qiweibaizhudan[J].Int J Curr Microbiol Appl Sci，2014，3（2）：198-207.

[11] 吳海，周賽男，郭純，等.一種基于 PCR 分析多樣性的小鼠腸道微生物宏基因組提取方法[J].中國微生態(tài)學雜志，2012，24（7）：648-651.

[12] Caporaso JG，Lauber CL，Walters WA，et al.Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J].The ISME Journal，2012，6（8）：1621.

[13] Round JL，Mazmanian SK.The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J].Nature Reviews Immunology，2009，9（5）：313.

[14] Liu S，Zhao L，Zhai Z，et al.Porcine epidemic diarrhea virus infection induced the unbalance of gut microbiota in piglets[J].Current Microbiology，2015，71（6）：643-649.

[15] Thomas F，Hehemann J，Rebuffet E，et al.Environmental and gut Bacteroidetes：The food connection[J]. Front Microbiol，2011，2：1-16.

[16] Gibiino G，Lopetuso LR，Scaldaferri F，et al. Exploring bacteroidetes：Metabolic key points and immunological tricks of our gut commensals[J].Dig Liver Dis，2018，50， 635-639.

[17] Laville E.Investigating host microbiota relationships through functional metagenomics[J]. Front Microbiol，2019， 10：1286.

[18] 郭抗蕭，尹抗抗，王歡，等.抗生素對小鼠菌群失調腹瀉腸道菌群多樣性的影響[J].中國微生態(tài)學雜志，2014， 26（3）：249-252.

[19] Liu HN，Wu H，Chen YZ，et al.Altered molecular signature of intestinal microbiota in irritable bowel syndrome patients compared with healthy controls：A systematic review and meta-analysis[J].Digestive and Liver Disease，2017，49（4）：331-337.

[20] Heeney DD，Gareau MG，Marco ML.Intestinal lactobacillus in health and disease，a driver or just along for the ride？[J].Current Opinion in Biotechnology，2018，49：140-147.

[21] Li J，Sung CYJ，Lee N，et al.Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2016，113（9）：E1306-E1315.

[22] Ohtsu T，Takagi A，Uemura N，et al.The ameliorating effect of Lactobacillus gasseri OLL2716 on functional dyspepsia in Helicobacter pylori-uninfected individuals：A randomized controlled study[J].Digestion，2017，96（2）：92-102.

[23] Muresan IAP，Pop LL，Dumitrascu DL.Lactobacillus reuteri versus triple therapy for the eradication of Helicobacter pylori in functional dyspepsia[J]. Med Pharm Rep，2019， 92（4）：352-355.

[24] Drissi F，Raoult D，Merhej V.Metabolic role of lactobacilli in weight modification in humans and animals[J].Microbial Pathogenesis，2017，106：182-194.

[25] Benson J，Rahim RA，Agrawal R.Newly arrived refugee children with Helicobacter pylori are thinner than their non-infected counterparts[J].Australian Journal of Primary Health，2017，23（1）：92-96.

[26] Koga Y，Ohtsu T，Kimura K，et al.Gasseri strain （LG21） for the upper gastrointestinal tract acting through improvement of indigenous microbiota[J]. BMJ Open Gastroenterol，2019，6（1）：e000314.

（收稿日期：2020-03-13）