畢 楊,林彤遠(yuǎn)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型分化是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓、腦卒中等。生物鐘系統(tǒng)是生物為適應(yīng)地球24 h的光暗循環(huán)而進(jìn)化出來的一種內(nèi)源性時(shí)鐘系統(tǒng)，由一系列生物鐘基因組成。多種生理狀態(tài)或者行為如睡眠、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均受生物鐘系統(tǒng)調(diào)控。生物鐘結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致多種疾病如睡眠呼吸暫停癥、非杓型血壓的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究[1-2]表明，VSMCs內(nèi)生物鐘基因，例如Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1，對(duì)血管平滑肌的表型分化具有調(diào)控作用,進(jìn)而影響疾病的進(jìn)程。在心血管疾病的高危因素中，高脂血癥[1]、高膽固醇[3]等均對(duì)VSMCs內(nèi)生物鐘基因表達(dá)節(jié)律產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化[4]。煙草中尼古丁是心血管疾病的頭號(hào)殺手，促進(jìn)VSMCs細(xì)胞表型分化[5]，導(dǎo)致不良的心血管事件發(fā)生。尼古丁對(duì)VSMCs細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因的表達(dá)節(jié)律是否有影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究提取了原代大鼠主動(dòng)脈VSMCs細(xì)胞，誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞表型分化的同時(shí)，檢測(cè)VSMCs細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因的表達(dá)節(jié)律，以期對(duì)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胎牛血清(Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；四氮唑藍(lán)(MTT)(天根生化科技有限公司)；總RNA提取試劑Trizol(碧云天生物科技有限公司)；QuantScript RT Kit(天根生化科技有限公司)；SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)；α-SMA抗體(Abcam公司)；引物序列(廣州瑞博生物科技有限公司)。尼古丁(Sigma公司)。

1.2 原代大鼠主動(dòng)脈VSMCs細(xì)胞培養(yǎng) 取體質(zhì)量150～200 g左右的SD大鼠，使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，隨后放置在75%乙醇中浸泡5 min消毒。切開大鼠胸腔，可見與脊柱并行的主動(dòng)脈血管，分離主動(dòng)脈血管，放入預(yù)冷的PBS中，洗去主動(dòng)脈血管表面的血跡。放入新的裝滿20%胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。套袖法去除大鼠主動(dòng)脈外的脂肪組織，用眼科剪沿血管中軸線將血管剪開，鑷子輕輕刮血管內(nèi)壁，除去血管內(nèi)皮細(xì)胞。用鑷子緩慢剝離血管中層，剪碎為大小1 mm×1 mm的組織塊。均勻鋪在T25培養(yǎng)瓶中，加入3～4 mL的20%胎牛血清培養(yǎng)基，倒置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中30 min后，緩慢翻正培養(yǎng)瓶，使液體均勻覆蓋在培養(yǎng)瓶底部。6～7 d后，VSMCs會(huì)從組織塊周圍爬出，用含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞傳代，使用免疫熒光法對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志性蛋白進(jìn)行鑒定。6～8代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 原代大鼠主動(dòng)脈VSMCs鑒定 VSMCs傳代、生長、融合后，會(huì)出現(xiàn)明顯的“峰”“谷”現(xiàn)象，從形態(tài)學(xué)角度被認(rèn)為是VSMCs特征(見圖1A)。使用免疫熒光法檢測(cè)VSMCs表面α-SMA蛋白。首先將細(xì)胞鋪板于96孔板上，使用4%多聚甲醛固定15 min后，PBS洗2遍，每遍3 min；然后加入用PBS配置的0.1% TritonX-100通透20 min；再加入5%胎牛血清封閉1 h。洗去PBS，用PBS按1∶200的比例稀釋?duì)?SMA一抗孵育過夜；最后加入熒光二抗，濕盒中避光1 h，DAPI染5 min，隨即用封片液封閉，在熒光顯微鏡下拍照合成(見圖1B)。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 細(xì)胞90%融合后，消化、鋪板于96孔板上，每孔3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，加入梯度尼古丁(10、100、1 000 nmol/L)刺激，在24 h時(shí)間內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞活力，確定尼古丁最佳給藥劑量。確定劑量后，使用最佳劑量尼古丁分別刺激細(xì)胞24、48、72 h，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。在96孔中加入5 mg/L的MTT，在37 ℃孵育4 h，緩慢吸盡上層培養(yǎng)基后，加入150 μL的DMSO溶液，輕輕震蕩15 min，使用酶標(biāo)儀在單波長490 nm處檢測(cè)各孔吸光度，計(jì)算增殖率。增殖率=(QD實(shí)驗(yàn)組-OD對(duì)照組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%

1.5 RT-PCR VSMCs于清晨8:00開始，用50%的胎牛血清授時(shí)2 h，授予細(xì)胞節(jié)律性，此時(shí)記為ZT 0[1]。然后洗去胎牛血清，加入尼古丁100 nmol/L，在28 h內(nèi)每隔4 h提取一次樣本。使用總RNA提取試劑Trizol提取細(xì)胞內(nèi)RNA含量，使用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，按照說明書步驟按兩步法將提取出的RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。在2 μL的cDNA中加入0.25 μmol的上下游引物以及5 μL的熒光染料2×SuperReal PreMix Plus，預(yù)變性后在95 ℃中10 s，62 ℃中30 s循環(huán)40次，用所得數(shù)據(jù)Cq值，用2-△△Cq法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中上下游引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析、q檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。28 h內(nèi)PCR實(shí)驗(yàn)所得的Cq值,使用余弦法擬合。使用Graphpad prism軟件將各組數(shù)據(jù)使用下列公式擬合：Y=Amplitude ×cos[(0.2618×(X-Phase)]+ Mesor。中值(Mesor)為24 h 余弦曲線的均值，振幅(Amplitude)為24 h內(nèi)余弦曲線最高值及最低值與中值的差值，相位(Phase)為24 h內(nèi)余弦曲線的最高值所在的時(shí)間點(diǎn)[6]。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁誘導(dǎo)原代VSMCs增殖 使用梯度的尼古丁刺激VSMCs 24 h發(fā)現(xiàn)，當(dāng)尼古丁濃度為100 nmol/L時(shí)刺激效果最好，增殖率可達(dá)25 %左右，且與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2、3)。隨后用100 nmol/L尼古丁分別刺激24、48、72 h發(fā)現(xiàn)，在48 h時(shí)間點(diǎn)效果最好，增殖率可達(dá)50 %左右，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 24h內(nèi)Nicotine梯度對(duì)VSMCs促增殖濃度效應(yīng)

表3 Nicotine(100 nmol/L)對(duì)VSMCs促增殖的時(shí)間效應(yīng)

2.2 尼古丁對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的影響 VSMCs加入尼古丁(100 nmol/L)刺激后，其細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)節(jié)律明顯改變。Bmal1和CLOCK基因的中值相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，Per1和Cry1基因表達(dá)上調(diào)，CLOCK基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，而Per1和Cry1上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，尼古丁使VSMCs內(nèi)生物鐘基因表達(dá)相位后移4～7 h(見圖2、表4)。

表4 生物鐘基因表達(dá)節(jié)律參數(shù)

3 討論

當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損，VSMCs暴露在血漿營養(yǎng)因子下，獲得了分化的能力，由靜止的、收縮的狀態(tài)發(fā)展成增殖的、分化的狀態(tài)，稱之為表型分化。研究[7-8]表明，VSMCs表型分化導(dǎo)致的血管壁增厚以及血管重構(gòu)是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ)。因此，研究如何調(diào)控VSMCs表型分化一直是心血管領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。生物鐘基因被報(bào)道可以調(diào)控血管平滑肌的表型分化，同時(shí)尼古丁作為心血管疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一，是否通過調(diào)控生物鐘基因的表達(dá)節(jié)律，進(jìn)而影響VSMCs功能，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文提取了原代大鼠主動(dòng)脈VSMCs，發(fā)現(xiàn)尼古丁在48 h內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的同時(shí)，對(duì)VSMCs內(nèi)生物鐘系統(tǒng)具有明顯的調(diào)控作用，本文研究的結(jié)果將加深對(duì)VSMCs所致的心血管疾病的認(rèn)識(shí)。

吸煙可以導(dǎo)致高血壓、腦血栓和動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生，尼古丁是煙草的主要成分，且已被證實(shí)可以改變多種血管壁相關(guān)細(xì)胞的功能，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷、VSMCs增殖等?，F(xiàn)有研究中，多種因素包括高脂血癥[1]、高膽固醇[3]、棕櫚酸[6]均使生物鐘基因表達(dá)節(jié)律的中值下調(diào)，造成細(xì)胞內(nèi)生物鐘系統(tǒng)的紊亂。在其他細(xì)胞系中，尼古丁可以顯著抑制多種生物鐘基因的表達(dá)[9]，但是該研究未在連續(xù)的時(shí)間變量下監(jiān)測(cè)生物鐘基因的表達(dá)。本研究中，100 nmol/L的尼古丁在48 h內(nèi)引起VSMCs的增殖的同時(shí)，Bmal1和CLOCK基因的中值相對(duì)于對(duì)照組顯著下調(diào)。不同于以上研究，Per1、Cry1基因的表達(dá)節(jié)律的中值明顯上調(diào)。這可能是因?yàn)樵谏镧姺答伃h(huán)路中，Per1、Cry1基因的表達(dá)上調(diào)會(huì)明顯抑制Bmal1和CLOCK基因，使Bmal1和CLOCK基因的表達(dá)下調(diào)，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的周期性反應(yīng)，而Per1、Cry1基因表達(dá)上調(diào)參與細(xì)胞的生長[10-11]。因此可以推測(cè)，雖然尼古丁使Bmal1和CLOCK基因表達(dá)中值下調(diào)，但是并沒有破壞細(xì)胞內(nèi)部的生物鐘反饋環(huán)路，使Per1、Cry1基因的表達(dá)中值上調(diào)的同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖。這可能由于所使用的尼古丁的濃度較小，研究[12]表明，在大劑量100 μmol/L時(shí)，尼古丁可以使VSMCs產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡。但是在這種條件下，對(duì)VSMCs內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的影響尚不可知，需要未來實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

振幅體現(xiàn)細(xì)胞節(jié)律的波動(dòng)情況。研究表明，血管緊張素Ⅱ[13]、氨茶堿[14]均能引起VSMCs內(nèi)生物鐘基因表達(dá)振幅的上調(diào)，表明氨茶堿引起的生物鐘基因振幅表達(dá)上調(diào)可以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，雖然Per1、Cry1基因表達(dá)振幅上調(diào)，但是致使Bmal1和CLOCK基因的表達(dá)振幅下調(diào)，Bmal1和CLOCK作為調(diào)控細(xì)胞晝夜節(jié)律的核心基因，振幅的下調(diào)意味著細(xì)胞的衰老[15]以及伸縮性[16]的下降,從而造成不良的心血管疾病。另一方面，尼古丁可以使VSMCs生物鐘基因的表達(dá)相位顯著后移4～7 h。現(xiàn)有研究中，不規(guī)律光照以及不規(guī)律飲食可以使生物鐘基因表達(dá)產(chǎn)生明顯的相位后移，其結(jié)果是與環(huán)境信號(hào)的晝夜節(jié)律不匹配，稱為晝夜節(jié)律失調(diào)[17-18]。而晝夜節(jié)律失調(diào)是心血管疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，本研究中VSMCs生物鐘基因的表達(dá)相位顯著后移，增加了心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，為尼古丁致心血管風(fēng)險(xiǎn)提供了生物節(jié)律方面的證據(jù)。

綜上所述，尼古丁在48 h內(nèi)，使VSMCs內(nèi)生物鐘基因Bmal1和CLOCK的表達(dá)節(jié)律中值、振幅顯著下調(diào)；Per1和Cry1基因表達(dá)節(jié)律中值與振幅明顯上調(diào)，同時(shí)使VSMCs內(nèi)生物鐘基因表達(dá)相位后約4～7 h，從而使VSMCs特異性增殖，進(jìn)而可能引發(fā)不良的心血管疾病。本文研究的結(jié)果加深了對(duì)尼古丁使VSMCs表型分化，繼而所致心血管疾病的認(rèn)識(shí)。