胡啟蒙，何 群，何建云，李蒙玉，楊宇新

(廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065000)

人類和動(dòng)物不育癥是世界性問題，其原因復(fù)雜，其中雄性不育所引起的約占40%[1]。傳統(tǒng)方法檢測(cè)或預(yù)測(cè)精卵受精功能已不能滿足現(xiàn)階段的研究需求，需要更加精準(zhǔn)的檢測(cè)，深入分子層面了解精子獲能及受精作用的機(jī)制，為解決哺乳動(dòng)物不孕不育作出判斷。

精子是一種高度分化的生殖細(xì)胞，其功能發(fā)揮是通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)完成的，信號(hào)通路的主要調(diào)控方式之一就是酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)[2]。精子蛋白通過(guò)酪氨酸磷酸化轉(zhuǎn)錄后修飾，保證精子受精完成的相關(guān)生理活動(dòng)順利進(jìn)行，其中包括精子活力、超激活運(yùn)動(dòng)(化學(xué)趨向性)、獲能、頂體反應(yīng)以及精子和透明帶結(jié)合，這些功能都受到蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的精準(zhǔn)調(diào)控，保證精子功能的正常發(fā)揮[3]。精子蛋白酪氨酸磷酸化過(guò)程受體內(nèi)和體外多種因素的影響，如精子所在內(nèi)環(huán)境的pH、體外環(huán)境等。

1 精子獲能

1951年是精子生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)鍵的一年，Austin(1951)和Change(1951)通過(guò)獨(dú)立研究大鼠(Rat)[4]和兔(Rabbit)[5]發(fā)現(xiàn)，排卵期懸浮于輸卵管中的精子無(wú)受精能力，但是如果存在于排卵期前幾小時(shí)的輸卵管中的精子則具有受精能力。后又進(jìn)一步研究了精子受精的生理機(jī)制，1952年Austin首次使用了“capacitation”，譯為“獲能”來(lái)描述精子需要經(jīng)歷具有時(shí)間依賴性的生理變化從而獲得受精能力。獲能過(guò)程具有物種特異性，有的物種完成獲能所用時(shí)間短，有的物種則耗時(shí)長(zhǎng)。精子獲能過(guò)程中頭部發(fā)生頂體反應(yīng)，精子質(zhì)膜與卵子的透明帶相融合，此時(shí)精子尾部具有超激活運(yùn)動(dòng)的能力，可穿越雌性生殖道輸卵管，穿透卵子透明帶[6]。

從精子獲能的發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)歷60年的時(shí)間，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)激發(fā)和支持精子獲能所必需的成分，其中包括HCO3-、Ca2+以及血清白蛋白等[7]，通過(guò)體外培養(yǎng)，獲得具有受精能力的精子。將體外獲能培養(yǎng)的精子作為研究對(duì)象，可進(jìn)一步了解精子受精能力的分子機(jī)理。

2 酪氨酸磷酸化與精子獲能

磷酸化是一種常見的翻譯后修飾作用，通過(guò)添加或去除酪氨酸、蘇氨酸或絲氨酸基團(tuán)，引起蛋白的活化或失活[3]。磷酸化不僅存在于真核細(xì)胞內(nèi)，也適用于原核細(xì)胞及細(xì)菌[8]。蛋白磷酸化可引起其結(jié)構(gòu)的變化，在細(xì)胞各功能中起極其重要的作用，如細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞凋亡及離子瞬間調(diào)控等。蛋白質(zhì)磷酸化在精子生理中也具有極其重要意義。

2.1 酪氨酸磷酸化與精子活力

精子向卵子有方向性的運(yùn)動(dòng)能力被稱為精子活力。精子活力是保證精卵受精成功的條件之一。精子運(yùn)動(dòng)能力弱或不動(dòng)的精子都不具備正常的生理功能。超激活運(yùn)動(dòng)是一種劇烈的精子運(yùn)動(dòng)模式，通過(guò)大幅度增加精子鞭毛不對(duì)稱擺動(dòng)，從而提供精子穿越卵子透明帶順利與卵子結(jié)合的動(dòng)力。超激活運(yùn)動(dòng)被視為精子獲能標(biāo)志，精子發(fā)生獲能過(guò)程極為復(fù)雜，獲能生理過(guò)程的調(diào)控信號(hào)通路，幾乎都涉及到蛋白酪氨酸磷酸化。Yanagimachi[9]研究發(fā)現(xiàn)附睪中的精子不能發(fā)生受精反應(yīng)，原因是其相關(guān)蛋白還未完成酪氨酸磷酸化反應(yīng)。精子在附睪中成熟后，通過(guò)射精作用，進(jìn)入雌性生殖道內(nèi)，受精作用前，精子的相關(guān)蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化調(diào)控獲能信號(hào)通路，完成獲能反應(yīng)，從而獲得受精能力，順利完成與卵子的結(jié)合。Visconti及其同事[10-11]研究證實(shí)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化過(guò)程與獲能和頂體反應(yīng)密切相關(guān)；有研究人員也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸磷酸化與精卵結(jié)合的關(guān)系。通過(guò)研究精子酪氨酸磷酸化反應(yīng)，了解精子受精能力的分子機(jī)制[12]。

目前有20多種蛋白與精子鞭毛纖維有關(guān)，人精子中存在有A型激酶錨定蛋白(A-kinase-anchoring proteins,AKAPs)和鈣結(jié)合酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白(Calcium-bingeing tyrosine phosphorylation-regulated protein,CABYR)，這些蛋白結(jié)合于精子鞭毛主段的纖維鞘上，可影響精子運(yùn)動(dòng)，此過(guò)程由蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)調(diào)控[12]，PKA抑制劑可有效的阻止精子發(fā)生超激活運(yùn)動(dòng)[13]。

肌動(dòng)蛋白聚合是精子獲能過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)作用。它是一個(gè)時(shí)間依賴性過(guò)程，從尾部開始，沿續(xù)至頭部。肌動(dòng)蛋白聚合對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)作用，肌動(dòng)蛋白解體對(duì)頂體反應(yīng)有促進(jìn)作用。肌動(dòng)蛋白的聚合由酪氨酸磷酸化控制，當(dāng)酪氨酸磷酸化過(guò)程被抑制，肌動(dòng)蛋白的聚合作用也被抑制，從而獲能反應(yīng)受到影響[14]。

2.2 酪氨酸磷酸化與頂體反應(yīng)

只有發(fā)生了獲能反應(yīng)的精子才能激發(fā)頂體反應(yīng)，頂體反應(yīng)可以保證精子與卵子順利結(jié)合[15]。與頂體反應(yīng)有關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸化種類已有研究，小鼠精子中Acrosin binding protein位于頂體上，獲能期間發(fā)生酪氨酸磷酸化，參與精子頂體反應(yīng)和透明帶融合[16]。

3 酪氨酸磷酸化與精子能量代謝

能量代謝是支持精子功能的重要條件。哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞內(nèi)能量的來(lái)源是ATP，ATP為精子運(yùn)動(dòng)、蛋白質(zhì)調(diào)控以及受精作用提供能量。精子相對(duì)于體細(xì)胞需要更多的ATP，不只是維持精子的運(yùn)動(dòng)，還因?yàn)樾枰{(diào)控獲能期間蛋白質(zhì)磷酸化[17]。獲能精子磷酸戊糖途徑有兩種關(guān)鍵酶，一種是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)和6-磷酸葡萄糖磷酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD)，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，提高cAMP的存在量以及蛋白酪氨酸磷酸化程度增加，均使這兩種酶活性提高。

糖酵解或氧化磷酸化過(guò)程是ATP的直接來(lái)源，這兩個(gè)途徑雖獨(dú)立存在發(fā)揮作用，但也相互協(xié)調(diào)共同為精子提供所需要的能量[18]。根據(jù)不同的物種特異性，精子獲取能量所依賴這兩種途徑的程度有所不同。

4 酪氨酸磷酸化信號(hào)通路

目前已知的調(diào)控精子蛋白酪氨酸磷酸化的通路是cAMP-PKA信號(hào)通路。細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度由腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclases，ACs)控制，哺乳動(dòng)物體內(nèi)含有兩種類型的ACs，一種是tmACs(transmembrane AC enzymes)，另一種為sAC(soluble AC)?？扇苄韵佘账岘h(huán)化酶可直接被HCO3-調(diào)控，精子獲能期間，質(zhì)膜發(fā)生膽固醇外流，HCO3-和Ca2+通過(guò)膜上離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活sAC，sAC水解ATP生成cAMP，cAMP可作為第二信使激活PKA[19]。試驗(yàn)還證實(shí)其他信號(hào)通路如磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)信號(hào)通路[20]、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路[21]和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號(hào)通路等可間接調(diào)控精子蛋白酪氨酸磷酸化水平[22]。

5 酪氨酸磷酸化影響因素

5.1 體內(nèi)因素

5.1.1 Ca2+鈣離子對(duì)精子蛋白磷酸化具有重要的調(diào)控作用，是精子功能完成的重要保證[23]。試驗(yàn)證明精子細(xì)胞中Ca2+在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)磷酸化方面具有雙重功能。低濃度鈣離子可以促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)和蛋白磷酸化程度，但鈣離子濃度較高時(shí)則會(huì)抑制精子運(yùn)動(dòng)能力[23]。鈣離子通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP和ATP的含量來(lái)調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)和蛋白磷酸化程度。其信號(hào)通路包括cAMP/PKA和Ca2+/CaM/CaMK[23]。

5.1.2 pH、HCO3-和BSA 獲能后精子才具有受精能力，獲能是受精的關(guān)鍵，Ca2+、HCO3-和BSA是精子體外獲能培養(yǎng)液的主要成分，是探究精子獲能的重點(diǎn)，也是調(diào)控酪氨酸磷酸化的重要影響因素[24]。精子獲能所依賴的一系列分子事件與雌性生殖道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。研究表明，雌性生殖道含有高濃度的HCO3-，其對(duì)精子運(yùn)動(dòng)、精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)以及頂體反應(yīng)起重要的調(diào)節(jié)作用。HCO3-是細(xì)胞內(nèi)的主要緩沖離子。在獲能過(guò)程中能通過(guò)非pH依賴性的方式直接刺激sAC，另外，其作用受PKA的調(diào)控，HCO3-濃度升高后，激活sAC，從而改變cAMP的濃度，而sAC是精子蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化必需的[13]。BSA可通過(guò)調(diào)節(jié)精子質(zhì)膜上的Ca2+通道，誘發(fā)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活cAMP/PKA依賴性信號(hào)系統(tǒng)并促進(jìn)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，最終使精子獲能[25]。

5.1.3 ROS 人類不育是影響人類健康的一個(gè)重大問題，男性不育病因復(fù)雜，其臨床表現(xiàn)為低精、絕精或精子無(wú)生理功能。不能生成正常功能精子的原因可能是精索靜脈曲張、隱睪癥、營(yíng)養(yǎng)不良、感染或創(chuàng)傷，也可能是生活環(huán)境污染、化學(xué)治療、吸煙或疾病。值得注意的是，所有上述條件的氧化應(yīng)激是作為其病理生理機(jī)制的重要組成部分[26]。

體內(nèi)的活化氧ROS氧化應(yīng)激反應(yīng)是由于生理過(guò)程中產(chǎn)生活性氧或者是抗氧化能力減弱(或兩者均存在)[26]，其作用于所有細(xì)胞成分。體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)精子獲能以及精子蛋白酪氨酸磷酸化作用是雙重的。低濃度ROS觸發(fā)獲能事件，如活化腺苷酸活化酶、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和磷酸化過(guò)程，最終蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化。當(dāng)精子所處環(huán)境氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)強(qiáng)時(shí)，精膜抗氧化酶水平低，精子的運(yùn)動(dòng)能力減弱、線粒體的活性降低[27]，甚至造成DNA破碎。其中30%～80%男性不育的原因是由于活性氧引起的精子損傷[28]。在體外獲能培養(yǎng)精子條件下，添加活性氧成分，精子酪氨酸磷酸化程度以及頂體反應(yīng)與未獲能精子相似[29]。

5.2 外界作用

5.2.1 細(xì)菌污染 研究報(bào)道細(xì)菌會(huì)影響豬精子質(zhì)量，例如獲能的指標(biāo)(精子活力下降，質(zhì)膜的排列紊亂，精子存活率降低以及磷酸化程度變化)下降。當(dāng)豬精子中綠膿桿菌的濃度高于106CFU/mL時(shí)，可顯著影響精子脂膜重新排列的程度，從而造成精卵融合速度降低，精子運(yùn)動(dòng)能力減弱，呈現(xiàn)較為典型的“似獲能”狀態(tài)，磷酸化程度也受到相應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，豬精液存在大腸桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、綠膿桿菌[30]。人工精子采集過(guò)程中，無(wú)法達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)，精液會(huì)受到細(xì)菌的侵染。正常射精過(guò)程中，精液中也會(huì)存在一系列的微生物，嚴(yán)重的情況下會(huì)影響精子功能和質(zhì)量，從而導(dǎo)致不育。

5.2.2 其他 BisphenolA (BPA) 是一種廣泛存在于環(huán)境中的污染物，會(huì)影響人類及其他哺乳動(dòng)物。其主要來(lái)源于食物包裝、工業(yè)原料、牙齒填充物等。BPA具有毒性以及環(huán)境殘留強(qiáng)的特性，目前受到公眾健康研究的重視。BPA作為激素?cái)_亂劑，可抑制雄性激素、甲狀腺激素生成。BPA暴露的方式主要是人類及動(dòng)物攝取受到BPA污染的食物，同時(shí)還可通過(guò)真皮吸收和呼吸途徑作用[31]。

氟化鈉是一種環(huán)境污染物，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下發(fā)現(xiàn)其對(duì)動(dòng)物具有雄性不育作用。近40多年，越來(lái)越多環(huán)境污染物中含有氟，其中氟化鈉的存在對(duì)于臨床和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有生理毒性，抑制細(xì)胞內(nèi)ATP和Ca2+的含量，對(duì)PKA活性也有影響，從而造成蛋白酪氨酸磷酸化的降低，影響正常雄性生殖功能[32]。

大黃素是中國(guó)傳統(tǒng)中藥成分，對(duì)小鼠精子功能具有一定影響，可抑制鈣離子的生成，降低蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化[33]。

環(huán)境毒物鉻(Cr，六價(jià))減少精子活力，降低蛋白酪氨酸磷酸化程度。高濃度的Cr降低體外培養(yǎng)的豬精子活力。Cr影響線粒體活性，減少ATP的產(chǎn)生，從而降低精子中段蛋白酪氨酸磷酸化的含量。Cr通過(guò)cAMP/PKA通路影響活力和蛋白酪氨酸磷酸化[34]。

6 展 望

哺乳動(dòng)物精子是一種高度分化的特異性生殖細(xì)胞，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，精子生理學(xué)得到了發(fā)展，特別是獲能精子生理研究進(jìn)入新階段。在臨床治療男性不育方面，通過(guò)阻斷獲能過(guò)程中關(guān)鍵酶控，阻止精子受精所研制出的男性避孕藥，減少意外懷孕風(fēng)險(xiǎn), 增加女性健康關(guān)愛的力度。在經(jīng)濟(jì)型家畜生產(chǎn)中，針對(duì)解凍后精子受精能力下降，找到合適的外界培養(yǎng)條件，減少低溫及氧化對(duì)精子的刺激，提高解凍后精子的受精能力。

但獲能精子蛋白酪氨酸磷酸化調(diào)控信號(hào)通路以及與代謝途徑的關(guān)系還未完全了解，其中酪氨酸磷酸化蛋白在獲能期間具體功能還需要后續(xù)研究。(1)深入研究哺乳動(dòng)物獲能精子中酪氨酸磷酸化蛋白在能量代謝途徑中的具體功能，可以進(jìn)一步了解氧化磷酸化途徑和糖酵解途徑在精子獲能中的作用。(2)精子蛋白酪氨酸磷酸化具有時(shí)間依賴性，可動(dòng)態(tài)研究獲能精子酪氨酸磷酸化過(guò)程。(3)借助基因剔除動(dòng)物的輔助實(shí)驗(yàn)，了解復(fù)雜的酪氨酸磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，感謝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)科學(xué)所作出的貢獻(xiàn)。