侯勝奎，陶晨雨，胡慧艷，劉 津，張 婧，賈 青,2,3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

20世紀(jì)90年代初，SRY基因被Sinclair等[1]首次在哺乳動(dòng)物性腺中發(fā)現(xiàn)，研究者發(fā)現(xiàn)SRY基因位于性染色體Y短臂擬常染色質(zhì)區(qū)，為單一外顯子，長(zhǎng)度為850 bp,為一性別決定基因。Koopman等[2]將含有SRY基因的DNA片段(14 kb)移植給XX染色體的雌鼠體內(nèi),在11只轉(zhuǎn)基因XX小鼠中，有3只成功實(shí)現(xiàn)性反轉(zhuǎn)成為雄性,通過(guò)這個(gè)試驗(yàn)揭示了動(dòng)物性控的奧秘。目前,有關(guān)研究人員利用SRY基因?qū)Σ溉閯?dòng)物(豬、袋鼠、猩猩、貓、狒狒、馬、羊、駱駝、犬、牛等)做了大量的性別鑒定試驗(yàn)[3-6],檢測(cè)結(jié)果表明雄性動(dòng)物全為陽(yáng)性，雌性動(dòng)物全為陰性，性別差異非常明了。因此，SRY基因已經(jīng)成為性別鑒定及選擇等方面應(yīng)用較成熟的基因。

本試驗(yàn)的目的是對(duì)公牛性染色體特異基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行公、母牛的性別鑒定。試驗(yàn)選擇雄性性別決定基因SRY，對(duì)其設(shè)計(jì)引物,對(duì)引物的靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)；并對(duì)公、母各20頭荷斯坦奶牛群體進(jìn)行了DNA樣品盲檢。通過(guò)對(duì)所設(shè)計(jì)引物靈敏度的檢測(cè)，判斷是否能夠滿足性別鑒定的需要，為后續(xù)的胚胎性別鑒定做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用中國(guó)黑白花奶牛血液樣品由徐水縣漕河鎮(zhèn)某奶牛專業(yè)合作社提供。

1.2 主要試劑

牛血液DNA提取試劑盒、2×Es Taq MasterMix(Dye)、ddH2O、染料(GelStain)、瓊脂糖(Agarose)、100 bp DNA Ladder,均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。特異引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成

1.3 DNA的提取

取300 μL加有抗凝劑的牛血液樣品，在樣品中加入10 μL RNase A去除樣品中的RNA，加入20 μL 蛋白酶K，500 μL Binding Buffer 3 (BB3)于樣品中，渦旋30秒充分把樣品混勻，把混勻的樣品封口放入水浴鍋中55 ℃過(guò)夜消化，把消化完全的樣品經(jīng)過(guò)短暫離心，然后把全部溶液加入到離心柱中，12 000×g離心60秒，倒掉過(guò)柱的液體。加入500 μL CB3溶液(已加入無(wú)水乙醇)，離心機(jī)12 000 ×g離心30秒，棄出液體。然后加入500 μL WB3溶液(已加入無(wú)水乙醇)，12 000 ×g離心30秒，棄出液體(此步驟重復(fù)2次)。12 000 ×g離心120秒，把殘留的WB3溶液徹底去除。把離心柱放入一個(gè)干凈的1.5 mL的離心管中，加入100 μL預(yù)熱的EB(提前60 ℃水浴鍋預(yù)熱)，室溫靜置120秒，10 000 ×g離心120秒，洗脫DNA(為得到高濃度的DNA可多次過(guò)柱)，收集到的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計(jì)

從GenBank檢索到牛SRY基因序列(AF148462)，采用Primer 5.0進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選確定了一對(duì)引物如下：上有引物F:5′-CCACGTCAAGCGACCCAT-3′下游引物R: 5′-AGAGCCACCTTTCGTCTTCG-3′ 退火溫度為60 ℃，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為66 bp。

1.5 PCR體系的建立

體系(25 μL):PCR反應(yīng)優(yōu)化程序：預(yù)變性94 ℃，5 min；循環(huán)94 ℃，30 s；66 ℃,5 s；72 ℃，30 s；32個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃，4 ℃保存(表1)。

1.6 PCR體系的應(yīng)用

1.6.1SRY基因的PCR擴(kuò)增 采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系對(duì)已提取的公牛DNA模板、母牛DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照。利用1.5% 的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物電泳30 min進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2 引物靈敏度檢測(cè) 用不同濃度的雄性DNA檢測(cè)引物的靈敏度，把提取的公牛DNA模板分別稀釋為125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，當(dāng)DNA模板濃度分別為125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL電泳條帶的亮度幾乎沒(méi)有差異，經(jīng)過(guò)篩選，選擇1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物電泳30 min進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3 隨機(jī)性別盲檢 取公、母牛各20 頭已提取DNA的血液樣本，覆蓋樣品標(biāo)記的公、母編號(hào)，采用SRY基因設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)40 個(gè)樣本DNA進(jìn)行PCR盲檢，判定公、母牛性別的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛SRY基因PCR瓊脂糖電泳結(jié)果

分別取4 頭公牛、1 頭母牛DNA樣本進(jìn)行PCR，設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，1～4泳道為公牛DNA樣本，目標(biāo)帶大小66 bp，電泳檢測(cè)有帶，證明為雄性；5泳道為母牛DNA樣本，電泳檢測(cè)證為雌性；6泳道為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果無(wú)帶，證明樣品沒(méi)有受到污染。

2.2 引物靈敏度檢測(cè)

對(duì)公牛已經(jīng)提取的DNA模板進(jìn)行稀釋，檢測(cè)引物的靈敏度。1～6泳道稀釋濃度分別為1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，按照已經(jīng)優(yōu)化的PCR體系條件對(duì)引物靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示濃度為0.32 pg/μL時(shí)電泳結(jié)果沒(méi)有條帶，引物最終靈敏度為1.6 pg/μL。

2.3 隨機(jī)性別盲檢結(jié)果

對(duì)已經(jīng)提取DNA的公、母牛各20 頭進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳盲檢，覆蓋其標(biāo)記的公、母編號(hào)，對(duì)瓊脂糖凝膠泳道進(jìn)行編號(hào)(圖3)，電泳結(jié)果表明2,4,5,9,11,14,17,19,21,22,25,27,29,30,33,34,35,37,39,40泳道為公牛DNA模板；1,3,6,7,8,10,12,13,15,16,18,20,23,24,26,28,31,32,36,38泳道為母牛DNA模板；發(fā)現(xiàn)公、母各占20 頭，完全和檢測(cè)前采樣標(biāo)記的公、母編號(hào)對(duì)的上，檢測(cè)準(zhǔn)確率100%。

3 討 論

3.1 選擇SRY基因作為特異基因的目的

SRY基因作為雄性特異基因，特異性比較強(qiáng)，宋淑珍[7]用綿羊SRY基因設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)綿羊的性別進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果非常準(zhǔn)確。本試驗(yàn)通過(guò)牛SRY基因設(shè)計(jì)的一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)對(duì)奶牛的性別成功進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)行了樣品的盲檢，性別鑒定準(zhǔn)確度達(dá)100%，與上述對(duì)綿羊性別鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。另外本試驗(yàn)還進(jìn)行了引物靈敏度檢測(cè)，結(jié)果顯示引物靈敏度達(dá)1.6 pg/μL，比張偉等[8]在多重PCR擴(kuò)增體系中的50 pg/μL和巢式PCR靈敏度5 pg/μL靈敏度都要靈敏。證明了本試驗(yàn)采用牛SRY特異基因設(shè)計(jì)引物和方法的有效可行。SRY基因作為Y染色體特異基因有著較強(qiáng)的特異性，是常用的性別鑒定基因，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都比較高。但由于該基因?yàn)閱慰截?，模板量低時(shí)很難達(dá)到較高的靈敏度[9]。

3.2 PCR擴(kuò)增技術(shù)的用途

PCR擴(kuò)增技術(shù)是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可以把生物體外的特殊DNA進(jìn)行復(fù)制。PCR技術(shù)在性別鑒定上的原理是找到一個(gè)雄性特異基因，對(duì)其設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有擴(kuò)增條帶的為雄性，未有擴(kuò)增條帶的為雌性。PCR技術(shù)在性別鑒定上的應(yīng)用，極大地提高了性別鑒定的準(zhǔn)確性，與其他性別鑒定方法相比較，縮短了鑒定時(shí)間，降低了試驗(yàn)成本是一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室能夠承擔(dān)得起的技術(shù)[10]。由于PCR擴(kuò)增技術(shù)極為靈敏，并且各種動(dòng)物Y基因序列同源性很高，很容易受到外源DNA的污染，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[11]。本試驗(yàn)也采用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的DNA樣本和目的條帶，對(duì)奶牛的性別進(jìn)行鑒定分析。

3.3 性別鑒定在奶牛生產(chǎn)上的應(yīng)用

性別鑒定不但能夠幫助人類減少性遺傳疾病的發(fā)生，而且可以挽救瀕臨滅亡的珍惜動(dòng)物[12]。更重要的是可以使乳用動(dòng)物多產(chǎn)母畜，肉用動(dòng)物多產(chǎn)公畜，從而滿足人們的需求[13]。性別鑒定可以提高奶牛性別鑒定的準(zhǔn)確性， 從而為奶牛胚胎性別的鑒定提供技術(shù)支持，以期增加母奶牛的數(shù)量，進(jìn)而增加奶牛數(shù)量和產(chǎn)奶量。如果性別鑒定能成熟應(yīng)用于奶牛場(chǎng)，會(huì)在一定程度上提高牛場(chǎng)的規(guī)模和經(jīng)濟(jì)效益。相信隨著科學(xué)的發(fā)展，奶牛早期胚胎鑒定的時(shí)間會(huì)縮短，鑒定的準(zhǔn)確性和特異性會(huì)增高。席繼鋒等[14]進(jìn)行特異性巢式PCR擴(kuò)增SRY基因以鑒定奶牛早期胚胎的性別，結(jié)果表明這種方法的鑒定準(zhǔn)確性較高。本試驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)能夠找到滿足性別鑒定需要的引物，提高胚胎鑒定的準(zhǔn)確性，與前人的研究結(jié)論一致。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)的牛雄性特異基因SRY引物符合試驗(yàn)預(yù)期并且能夠很好的滿足性別鑒定的需要；用該引物進(jìn)行奶牛性別鑒定的準(zhǔn)確度為100%。