李冬冬 田雪芬 王 靜 周 瑋 張丹丹

山東省濟寧市中醫(yī)院，山東 濟寧 272037

二黃益腎湯是我院腎病科老中醫(yī)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗，總結(jié)出的經(jīng)驗方，是由丹參、黃芪、大黃、炒白術(shù)、炙淫羊藿、莪術(shù)、砂仁、石葦?shù)?0味中藥采用傳統(tǒng)工藝結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)制成的口服液體劑型，具有補腎健脾、活血通絡(luò)、清熱泄?jié)嶂π?，可降低?nèi)生肌酐和尿素氮水平，臨床上主要用于氣虛濕瘀型慢性腎功能不全的治療。該方療效顯著，不良反應(yīng)小，使用安全，深受廣大患者的好評。方中大黃為君藥，性苦、寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃素能明顯減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織病理學(xué)損傷程度，且大鼠腎組織PDGF-B表達明顯減少，說明大黃素能夠減緩腎組織纖維化進程，具有腎臟保護作用[1]；大黃酸可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HBZY-1大鼠腎小球系膜細胞的增殖，可以降低血清肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平[2]。

二黃益腎湯現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只有【性狀】及【檢查】項，無【鑒別】與【含量測定】項，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不完善。為有效控制本制劑的質(zhì)量，完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保障臨床用藥的安全、有效，故對丹參和黃芪采用TLC進行定性鑒別，對大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚采用RP-HPLC進行定量測定，本研究從TLC和RP-HPLC兩方面入手，建立該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)；AB135-S型十萬級電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；ZF-8暗箱三用紫外分析儀(上海一科儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參對照藥材(批號120923-201615)；黃芪對照藥材(批號120974-201612)；大黃酸(純度≥99%，批號110757-201607)；大黃素(純度≥98%，批號110756-201512)；大黃酚(純度≥99%，批號110796-201621)；黃芪甲苷(純度≥97%，批號110781-201717)均來自于中國食品藥品檢定研究院。

二黃益腎湯(規(guī)格：每瓶150 mL，濟寧市中醫(yī)院制劑室制，批號：20181014、20181129、20181227)。

甲醇(色譜純，Avantor Performance Materials, Inc., USA; GC≥99.9%)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[3]

2.1.1 丹參[4]取本品(批號20181014)20 mL，加10%稀鹽酸調(diào)pH至2.0，再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次50 mL，合并兩次提取液，揮干乙酸乙酯，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。取除丹參以外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對照溶液。再取丹參對照藥材0.6 g，加水100 mL，加熱回流1.5 h，濾過，濾液濃縮至約20 mL，放冷，按供試品的制備方法處理，即得對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，依次吸取對照藥材溶液5 μL、供試品溶液8 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴3%三氯化鐵乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。如圖1所示。

2.1.2 黃芪[5-7]取本品(批號20181014)25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(首次輕輕振搖)，每次40 mL，合并提取液，用氨液洗滌 2 次(50 mL、30 mL)，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液。取除黃芪外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成不含黃芪的溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對照溶液。取黃芪對照藥材2.0 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約20 mL，同法即得對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成l mg·mL-1的溶液，即得對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取對照品溶液和對照藥材溶液各4 μL、供試品溶液8 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置超過6 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點，相應(yīng)位置處陰性對照無斑點。如圖2所示。

2.2 含量測定

2.2.1 對照品混合儲備液的制備 分別精密稱取大黃素對照品、大黃酸對照品和大黃酚對照品各2.13、6.66和2.22 mg，分別置于5 mL、1 mL和2 mL量瓶中，用甲醇至刻度，搖勻，各吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得0.0426 mg·mL-1大黃素對照品、0.666 mg·mL-1大黃酸對照品和0.111 mg·mL-1大黃酚對照品混合儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備[3,8-10]精密量取樣品(批號20181129)50 mL，置燒瓶中，加8%鹽酸100 mL，超聲處理3 min，再加三氯甲烷150 mL，水浴回流40 min，放冷，三氯甲烷層置分液漏斗中，再用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，上層酸液再用150 mL三氯甲烷水浴回流一次(20 min)，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次100 mL，合并提取液，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件[11-13]Purospher star RP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30)為流動相；檢測波長為255 nm；柱溫為25 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項下的對照品混合儲備液，用甲醇逐級稀釋成41.625、83.25、166.5、333.0、499.5、666.0 μg·mL-1的大黃酸對照品和2.663、5.325、10.65、21.3、31.95、42.6 μg·mL-1的大黃素對照品以及6.94、13.88、27.75、55.5、83.25、111.0 μg·mL-1的大黃酚對照品混合溶液，不同濃度的對照品混合溶液各進樣8 μL，按2.2.3項下色譜條件進行測定，記錄對應(yīng)峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得大黃酸的回歸方程為Y=6472.816X-5364.543，r=1.000 0，線性范圍為41.625～666.0 μg·mL-1；大黃素的回歸方程為Y=27439.750X-26299.681，r=0.999 9，線性范圍為2.663～42.6 μg·mL-1；大黃酚的回歸方程為Y=13646.903X-23053.364，r=0.999 9，線性范圍為6.94～111.0 μg·mL-1。

2.2.5. 方法學(xué)驗證[14-15]

2.2.5.1 精密度試驗 取2.2.1項下對照品混合儲備液6 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為1.36%、1.08%和1.44%。結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取2.2.2項下供試品溶液5 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項下色譜條件操作，分別于0、4、8、12、16、24 h間隔下進樣，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.26%、2.98%和2.89%。由結(jié)果可知，供試品中的3種化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品(批號20181129)，按2.2.2項下方法制成6份供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件操作，均進樣1次，記錄峰面積，計算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.29%、2.06%和2.18%。由結(jié)果可知，方法重復(fù)性良好。

2.2.5.4 加樣回收率試驗 平行取6份已知含量的同一批號樣品(批號20181129)各50 mL，分別加入含量相當(dāng)量80%、100%、120%的大黃酸、大黃素和大黃酚混合對照品，按2.2.2項下的方法制備成溶液，每次進樣5 μL，結(jié)果見表1。大黃酸平均回收率為97.45%，RSD為0.39%；大黃素平均回收率為98.63%，RSD為1.18%；大黃酚平均回收率為98.15%，RSD為0.89%。

表1 回收率試驗結(jié)果 (n=6)

續(xù)表1 表1 回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.2.6 專屬性 按處方和工藝制成不含大黃的陰性對照樣品，再按2.2.2項下方法制成陰性對照溶液。標(biāo)準(zhǔn)品混合儲備液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL進樣，按上述色譜條件進行測定?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品、供試品和陰性對照的HPLC圖如圖3所示。

2.2.7 定量限、檢測限 取對照品溶液逐級稀釋，取信噪比S/N為10的作為定量限，大黃酸、大黃素和大黃酚的定量限分別為4.386、5.532、9.470 ng；取信噪比S/N為3的作為檢測限，分別為2.525、4.056、6.061 ng。

2.2.8 樣品含量測定 取3批樣品，按2.2.2項下方法平行制備兩份，分別測定，計算二黃益腎湯樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量，結(jié)果見表2。

表2 二黃益腎湯中大黃酸、大黃素和大黃酚含量測定結(jié)果 (mg·mL-1，n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 二黃益腎湯主要是由大黃、丹參、黃芪、炙淫羊藿、炒白術(shù)、莪術(shù)等10味中藥組成，其中大黃為君藥，丹參、黃芪等為臣藥，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無薄層鑒別項，因此定性鑒別選擇方中的臣藥加以研究。

黃芪的薄層鑒別中，樣品用水飽和的正丁醇提取后再用氨水洗滌，薄層展開時發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，斑點相互有干擾，因此樣品處理時最后添加了正丁醇飽和的水洗滌這一步驟，可以除去樣品中極性較小的雜質(zhì)；用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑進行鑒別時，發(fā)現(xiàn)10 ℃以下放置超過6 h的展開劑能有效降低斑點的拖尾，可以得到較好的展開效果。

3.2 含量測定 大黃作為方中的君藥，具有降低尿素氮、保護殘存腎功能、延緩腎纖維化等作用，其有效成分主要以蒽醌類為主，分為結(jié)合蒽醌和游離蒽醌，游離蒽醌的成分有大黃素、大黃酸和大黃酚等，這些都是大黃發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)[16]。大黃在提取過程中，游離蒽醌的損失量遠高于結(jié)合蒽醌，導(dǎo)致游離蒽醌在溶液中的含量很低；另外，游離蒽醌在口服后，易在上消化道部位吸收[17]，最終到達大腸的量極有限，因此本試驗對總蒽醌進行定量測定。

樣品處理時，參考2015版《中華人民共和國藥典》大黃含量測定中總蒽醌的處理方法，先用8%鹽酸進行酸水解，再用三氯甲烷萃取。但封淑華等[18]報道酸水解時酸的濃度對大黃酸有較大影響，對其他物質(zhì)影響極小，因此本試驗中酸的濃度直接采用2015版《中華人民共和國藥典》大黃供試品溶液的制備方法。

參考文獻[11-12,19]，流動相先后嘗試了甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30、76∶24、80∶20、85∶15等多種洗脫程序，其中76∶24時大黃酸主峰與其前面的雜質(zhì)峰連在一起，隨著甲醇比例的提高，大黃酸主峰與雜質(zhì)峰近乎無法分離開。之后將甲醇的比例在70%左右調(diào)節(jié)，綜合比較其分離度、拖尾因子、峰面積和經(jīng)濟性等指標(biāo)，最終選定甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30作為本試驗的流動相系統(tǒng)。

本試驗使用二極管陣列檢測器(PDA)進行全波長掃描(190～800 nm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃樣品在255 nm處3個成分具有較大的吸收，且雜質(zhì)成分干擾少，故以255 nm作為大黃的檢測波長。

4 結(jié)論

本研究建立的質(zhì)量控制方法，經(jīng)過對多批產(chǎn)品的驗證，結(jié)果表明薄層色譜法中斑點分離效果好，陰性溶液對樣品的定性鑒別無干擾，方法的專屬性較強。含量測定試驗，具有良好的重復(fù)性，加樣回收率高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。增加的薄層色譜鑒別和含量測定項，能有效控制二黃益腎湯的質(zhì)量，對二黃益腎湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定提高作用。