朱玉芳 劉瀟瀟

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663

健婦膠囊由海狗腎、鹿胎、山茱萸、酒當(dāng)歸、炒白術(shù)等11 味藥組成，具有補(bǔ)血養(yǎng)血，活血化瘀，調(diào)經(jīng)止帶的功效，臨床常用于治療赤白帶下、血崩血漏、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)[1]。酒當(dāng)歸活血通經(jīng)，為本方中主要藥味之一，主含阿魏酸、揮發(fā)油、維生素B12、葉酸等成分[2-5]。健婦膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中酒當(dāng)歸含量測定方法操作繁雜，結(jié)果重現(xiàn)性差，提取效率低。為了更加有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保療效，本研究從化合物的性質(zhì)和規(guī)律入手，對原提取方法進(jìn)行改進(jìn)，建立HPLC法測定健婦膠囊中阿魏酸的含量，為健婦膠囊質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司)；Sartorius CP244S/CP225D電子天平(德國Sartorius公司)；Thermo Fisher D低溫離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；Elmasonic S 300H超聲儀(德國Elma公司)；Milli-Q超純水制備儀( 美國Millipore 公司) 。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，含量以99.0%計)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純；健婦膠囊(批號：130801、131001、131201、141101、141102、141103、160401、160402、160403)，缺當(dāng)歸陰性樣品由實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 SHARPSIL -H C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-1%醋酸溶液(35∶65)，檢測波長為322 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸20μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%碳酸鈉溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率350 W，頻率37kHz)20分鐘，放冷，再稱定重量，用5%碳酸鈉溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘5000轉(zhuǎn))8 min，精密吸取上清液25 mL，用乙醚洗滌2次，每次25 mL，棄去乙醚液，水溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，用乙醚振搖提取5次，每次25 mL，合并乙醚提取液，低溫水浴揮干乙醚，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺當(dāng)歸陰性對照樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，分別按“2.1”項下條件測定，記錄色譜圖，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液顯示對應(yīng)的色譜峰，陰性對照溶液無對應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明，陰性溶液對檢測結(jié)果無干擾。如圖1所示。

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對照品0.01210 g(十萬分之一天平稱取)，加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸19.1664 μg的對照品溶液，分別精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項下條件測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，其回歸方程為：Y=7.3E+6X-3773.0(r=1.0000)，阿魏酸在0.02～0.48 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗 精密吸取濃度為19.1664 μg/mL的阿魏酸對照品溶液10 μL，按“2.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得阿魏酸峰面積的RSD=0.1%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于1、4、8、12、16、20、24 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測得樣品中阿魏酸峰面積的RSD=0.2%。說明樣品中阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 取健婦膠囊樣品(批號：160401)6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，結(jié)果RSD為0.8%，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗 取已知阿魏酸含量的樣品(批號：160401)6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入濃度為17.9685 μg/mL的對照品溶液5 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，平均回收率為91.3%，RSD為1.3%，表明該方法可行。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.11 樣品的含量測定 取健婦膠囊樣品九批，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下條件測定，計算阿魏酸的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取阿魏酸對照品溶液在210～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在波長為322 nm處有最大吸收，故以322 nm作為阿魏酸的檢測波長。如圖2所示。

3.2 提取溶劑的選擇 阿魏酸化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸(Ferulic acid)，是一種芳香酸，在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在，主要與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結(jié)合態(tài)。根據(jù)阿魏酸的理化性質(zhì)，采用堿解法可以水解出游離態(tài)的阿魏酸，故選取5%碳酸鈉提取結(jié)合乙醚萃取以增加阿魏酸的提取率。取3批樣品(批號：160403、160402、160401)，分別按原方法和新建立的方法對酒當(dāng)歸中的阿魏酸進(jìn)行測定，結(jié)果表明，采用新建立的方法測定健婦膠囊中阿魏酸的含量結(jié)果約為按照原測定結(jié)果的3倍，可見原方法對樣品中阿魏酸提取不完全，其原因是原方法標(biāo)準(zhǔn)采用乙醚作為提取溶劑，僅檢測出游離態(tài)的阿魏酸，提取效率低。采用5%碳酸鈉溶液提取，能水解結(jié)合態(tài)的阿魏酸，提取效率高，能更好地對健婦膠囊中的酒當(dāng)歸進(jìn)行質(zhì)量控制。見表3。

3.3 含酒當(dāng)歸中成藥的質(zhì)量控制 《中國藥典》2015年版一部收載含酒當(dāng)歸的中成藥品種中，有8個(小金丸/片/膠囊、中風(fēng)回春丸/片、當(dāng)歸龍薈丸、固本益腸片、參茸白鳳丸、參茸固本片、獨活寄生丸、豨薟通栓丸/膠囊)均采用薄層色譜法對其中酒當(dāng)歸進(jìn)行檢測，其前處理方法中，中風(fēng)回春丸/片采用加氨水提取，其他品種均采用直接用乙醚提取。鑒于薄層色譜鑒別不需進(jìn)行回收率考察，故采用乙醚提取即可。據(jù)文獻(xiàn)報道[6-10]，采用高效液相色譜法對中成藥中酒當(dāng)歸進(jìn)行阿魏酸含量測定，其前處理方法大多采用加堿溶液進(jìn)行提取，以保證提取完全，回收率符合藥典規(guī)定。因此，對于中成藥中酒當(dāng)歸的質(zhì)量控制，可視處方組成、處方量及制法采用適宜的檢測方法，進(jìn)而確定科學(xué)簡捷的前處理方法。

表3 兩種不同方法的樣品測定結(jié)果

3.4 結(jié)論 酒當(dāng)歸能活血通經(jīng)，當(dāng)歸經(jīng)過酒炙，活血作用增強(qiáng)，是健婦膠囊處方中重要藥味之一。健婦膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JZ20020011，為2000年前研發(fā)，已不符合實際需要，因此，需要優(yōu)化酒當(dāng)歸中阿魏酸的含量測定方法。本實驗所建立的阿魏酸測定方法較原方法提取效率高了3倍，操作更加簡便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于健婦膠囊中阿魏酸的含量測定，為中成藥中酒當(dāng)歸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。