李紅光，劉俊靈，趙政陽，郝貝貝，韓立新，勾真真

(1.三門峽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/河南省蘋果栽培工程技術(shù)研究中心，河南 三門峽 472000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

水果是生活中必備的食品，它為人體提供了維生素等營養(yǎng)成分。在市場中，質(zhì)地是果實(shí)的重要屬性[1〗，直接決定著消費(fèi)者的選擇[2]，同時(shí)也影響著果實(shí)的貯藏性和運(yùn)輸性等[3]。果實(shí)的質(zhì)地特征包括：硬度、脆度、多汁性等[4]。果實(shí)質(zhì)地是一個(gè)復(fù)雜的性狀，其取決于果實(shí)的細(xì)胞形態(tài)、膨壓以及細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度等[5]。果實(shí)的微觀結(jié)構(gòu)是影響質(zhì)地的重要內(nèi)在因素[6]，因此，分析果實(shí)組織的微觀結(jié)構(gòu)，將有利于解釋果實(shí)質(zhì)地和果肉細(xì)胞的關(guān)系。

近年來，隨著顯微鏡技術(shù)的飛速發(fā)展，其在生物學(xué)應(yīng)用的越來越廣泛，已經(jīng)成為了一項(xiàng)重要的技術(shù)手段。在園藝作物研究中，顯微鏡多運(yùn)用于研究果實(shí)微觀結(jié)構(gòu)的二維或三維成像，作為連接微觀結(jié)構(gòu)和宏觀質(zhì)地的橋梁。光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡用于觀察果實(shí)的形態(tài)特征，透射電子顯微鏡多用于觀察細(xì)胞壁，而原子力學(xué)顯微鏡主要用于分析細(xì)胞壁多糖的納米結(jié)構(gòu)。

因此，筆者結(jié)合國內(nèi)外最新的研究進(jìn)展，就顯微鏡技術(shù)在果實(shí)的微觀結(jié)構(gòu)方面的應(yīng)用和作用等方面展開了綜述，以期為果實(shí)質(zhì)地研究提供理論依據(jù)。

1 光學(xué)顯微鏡技術(shù)(LM)

1.1 光學(xué)顯微鏡的制片種類

在果實(shí)質(zhì)地結(jié)構(gòu)的研究中，通常通過光鏡觀察果實(shí)的組織切片，而目前常用的技術(shù)有石蠟切片和半薄切片。兩種切片相比，半薄切片厚度更薄，成像更清晰，圖像效果更好。通過光學(xué)顯微鏡，可以觀察到果實(shí)的大小、形狀、排列等。

1.2 光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用

李紅光等[7]通過觀察蘋果果實(shí)的半薄切片，發(fā)現(xiàn)質(zhì)地松脆的富士細(xì)胞明顯大于質(zhì)地粗糙的秦冠，也有研究表明不同品種蘋果的形狀、排列存在顯著差異，可能與果實(shí)的硬度和失重率有關(guān)[8～9]，Nieto等[10]觀察到蘋果切片在脫水過程中的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)巨大的變化。另外，相關(guān)研究表明，漿果類果實(shí)的質(zhì)地和細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)。對(duì)硬度不同的3個(gè)黑莓果肉細(xì)胞觀察，發(fā)現(xiàn)品種之間細(xì)胞的排列緊密程度、大小等差異較大，即果肉的硬度和解剖結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系[11]。此外，通過比較幾個(gè)葡萄品種的組織結(jié)構(gòu)，貯藏性好的品種細(xì)胞排列較密，大小一致，不同品種間表皮細(xì)胞和果肉細(xì)胞均存在明顯差異[12]。李三培等[13]觀察了不同口感的甜瓜果實(shí)的切片，并采用圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞參數(shù)，發(fā)現(xiàn)了質(zhì)地不同的甜瓜果實(shí)在成熟過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化，明確了甜瓜果實(shí)質(zhì)地和細(xì)胞參數(shù)之間的關(guān)系。上述結(jié)果表明，果實(shí)的細(xì)胞形態(tài)特征和質(zhì)地存在一定關(guān)系。通過光學(xué)顯微鏡可以清楚地觀察到果實(shí)的組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合圖像分析軟件，把細(xì)胞的形態(tài)特征量化，更加具有科學(xué)性。

2 掃描電子顯微鏡(SEM)

2.1 掃描電子顯微鏡(SEM)的種類

掃描電子顯微鏡有三種類型：常規(guī)掃描電子顯微鏡，冷凍掃描電子顯微鏡和環(huán)境掃描電子顯微鏡。常規(guī)掃描電鏡的樣品一旦干燥，樣品較為堅(jiān)固，適合于長時(shí)間的檢查，可以分裝或儲(chǔ)存，但是果肉組織必須固定，干燥過程中顯著改變了細(xì)胞壁的自然狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞壁收縮，使細(xì)胞發(fā)生變形；冷凍電子顯微鏡的樣品固定快速，有助于保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)原始形態(tài)，適合于水含量較高的樣品；環(huán)境掃描電子顯微鏡使用新鮮的樣品，其最接近于自然狀態(tài)的，操作步驟簡單，但樣品只能在相對(duì)較低的放大倍數(shù)內(nèi)觀察，且樣品比較脆弱，不穩(wěn)定，因此不適合長時(shí)間觀察[14]。

2.2 掃描電子顯微鏡(SEM)的應(yīng)用

運(yùn)用掃描電子顯微鏡可以清晰地觀察到果實(shí)的超微結(jié)構(gòu)。例如：楊生寶等[15]研究表明，不同番茄品種的果實(shí)由于硬度差異，它們的掃描電鏡結(jié)果也存在明顯的差異；也有研究發(fā)現(xiàn)，在番茄果實(shí)成熟中，果肉的細(xì)胞間發(fā)生了分離[16]。在蘋果的研究中，通過對(duì)不同品種蘋果果肉的切面觀察，研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)地較好的品種果肉細(xì)胞較大，排列更加緊密[7]；冷凍電子顯微鏡觀察到兩個(gè)不同蘋果品種在貯藏過程中果肉組織結(jié)構(gòu)的變化可能與果肉的宏觀結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。

在發(fā)育和貯藏過程中，伴隨著果實(shí)的衰老，其超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。常規(guī)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)鈣處理過的金冠蘋果相較于未處理的果實(shí)仍然可以保持細(xì)胞內(nèi)斷裂[18]；林建成等[19]對(duì)枇杷果實(shí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在貯藏中果實(shí)的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；有研究表明，不同品種橄欖果實(shí)在發(fā)育過程中果肉的斷裂方式存在差異，可能與細(xì)胞壁多糖的變化有關(guān)[20]。上述研究表明，掃描電子顯微鏡在觀察果實(shí)的結(jié)構(gòu)變化發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)，其研究手段經(jīng)常和外界物理或則化學(xué)處理相聯(lián)系。

3 透射電子顯微鏡(TEM)的應(yīng)用

透射電子顯微鏡一般用來研究果實(shí)在發(fā)育、成熟、貯藏過程中的變化以及不同處理?xiàng)l件下果實(shí)超微結(jié)構(gòu)的變化。研究者一般主要以果實(shí)的細(xì)胞器和細(xì)胞壁為主要目標(biāo)對(duì)象。在桃果實(shí)的研究中，段玉權(quán)等[21]研究發(fā)現(xiàn)1-甲基環(huán)丙烯處理桃果實(shí)，可以保持桃果肉細(xì)胞的完整性，延長貯藏時(shí)間；成熟程度不同的桃果實(shí)在貯藏過程中果肉的細(xì)胞壁降解程度不同，成熟程度和桃的耐貯性有關(guān)[22]；此外，不同質(zhì)地類型的桃品種，其果實(shí)在成熟過程中果肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化存在著顯著差異，硬度大的品種，細(xì)胞壁降解較晚[23]，李銀等[24]也有類似的研究結(jié)果。另外，在南方水果的研究中，辜青青等[25]以化渣性不同的橘子為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)三個(gè)品種果肉的細(xì)胞壁微纖絲存在明顯差異；甜橙果實(shí)在發(fā)育過程中，囊衣細(xì)胞細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了巨大的變化[26]；也有研究表明，不同生長環(huán)境條件下，臍橙果肉的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，尤其表現(xiàn)在瓤囊壁上[27]。

同時(shí)，透射電子顯微鏡在蘋果的應(yīng)用研究也很多。不同品種蘋果果實(shí)在發(fā)育和成熟過程中，果肉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生著明顯的改變[28]，同時(shí)，研究表明不同質(zhì)地蘋果果實(shí)在貯藏過程中果實(shí)的細(xì)胞壁變化也存在一定差異[8]；劉會(huì)超等[29]發(fā)現(xiàn)在使用鈣處理蘋果果實(shí)以后，明顯抑制了果實(shí)的生長，果實(shí)的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。

4 原子力學(xué)顯微鏡(AFM)

4.1 原子力學(xué)顯微鏡(AFM)的作用

近年來，原子力學(xué)顯微鏡越來越多地被用于果實(shí)的微觀結(jié)構(gòu)研究。與其他顯微鏡技術(shù)相比，原子力學(xué)顯微鏡的分辨率較高，對(duì)環(huán)境要求低，適用范圍廣，且預(yù)處理簡單方便；它通過掃描得到圖的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行粗糙度、步寬等分析，可以研究組織的納米結(jié)構(gòu)特征[30]。

4.2 原子力學(xué)顯微鏡(AFM)的應(yīng)用

近些年，原子力學(xué)顯微鏡作為一種先進(jìn)的儀器，在園藝作物研究中有著廣泛的應(yīng)用。例如，通過原子力顯微鏡，Cybulska等[31]研究了6個(gè)不同蘋果品種細(xì)胞壁與質(zhì)地的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)纖維素的厚度對(duì)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度有一定的影響。在對(duì)2個(gè)硬度不同的梨品種的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果膠分子降解較少，厚度大的品種，果實(shí)硬度更高，質(zhì)地更好；同時(shí)，半纖維素的分子結(jié)構(gòu)也影響著果實(shí)的質(zhì)地[32]。此外，楊宏順[33]研究發(fā)現(xiàn)在貯藏中黃桃果肉中果膠的納米結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，從微觀結(jié)構(gòu)方面解釋了黃桃果實(shí)的生理變化。在草莓研究中，觀察分析了成熟草莓果膠分子的結(jié)構(gòu)特征，揭示了果膠組分中的聚合物在果實(shí)軟化過程有著重要作用[34]。由于果實(shí)質(zhì)地和細(xì)胞壁特征有著密切的關(guān)系，而細(xì)胞壁包含果膠、纖維素等成分，因此，原子力學(xué)顯微鏡在研究果實(shí)質(zhì)地時(shí)，主要集中在研究果膠、纖維素的納米結(jié)構(gòu)方面。

5 展望

物體的結(jié)構(gòu)決定功能，微觀結(jié)構(gòu)的差異決定了果實(shí)質(zhì)地的多樣性。在果實(shí)質(zhì)地方面，果實(shí)的組織結(jié)構(gòu)和質(zhì)地特性緊密相關(guān)。4種顯微鏡可以從不同角度和方面探究果實(shí)的顯微和超微結(jié)構(gòu)，為果實(shí)質(zhì)地研究提供了更為全面的理論依據(jù)。

果實(shí)質(zhì)地是一個(gè)非常復(fù)雜的特征，受很多因素影響。通過對(duì)果實(shí)質(zhì)地的微觀結(jié)構(gòu)分析，可以從微觀層次揭示果實(shí)的質(zhì)地特性，最終為建立果實(shí)質(zhì)地的模型提供依據(jù)，以探究微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)地差異的關(guān)系，從結(jié)構(gòu)性質(zhì)出發(fā)探究果實(shí)質(zhì)地。目前，多數(shù)研究單獨(dú)地運(yùn)用一種顯微鏡觀察果實(shí)的組織結(jié)構(gòu)，對(duì)質(zhì)地的研究多停留在單一方面，并沒有把多種方面聯(lián)系起來，研究不夠深入。因此，在今后的質(zhì)地研究中，運(yùn)用多種顯微鏡技術(shù)手段，全面地分析果實(shí)質(zhì)地的組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)，結(jié)合力學(xué)和幾何學(xué)等相關(guān)交叉學(xué)科知識(shí)，建立果實(shí)質(zhì)地的模型，這將是以后的研究重點(diǎn)。