劉瑞，張弘弛，*，延文星，周鳳，李慧

（1.大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009；2.大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西大同037009）

在20世紀(jì)70年代，國(guó)外在醫(yī)藥行業(yè)、污水處理行業(yè)就廣泛地使用了大孔吸附樹(shù)脂用以除去污水中的有害物質(zhì)，分離天然藥物中的有效成分。其吸附分離過(guò)程綜合了機(jī)械篩分和化學(xué)吸附原理，具有吸附性獨(dú)特、選擇性高、不受無(wú)機(jī)物影響、使用周期長(zhǎng)、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于皂苷類物質(zhì)的提取[1-2]。有關(guān)大孔樹(shù)脂對(duì)中藥中皂苷類和黃酮類成分純化的報(bào)道已有不少，但對(duì)黃芪中總皂苷類成分的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[3-4]。

在我國(guó)的內(nèi)蒙包頭、山西渾源、甘肅隴西、山東萊陽(yáng)等地均有黃芪生長(zhǎng)。其中以山西渾源、甘肅隴西的黃芪最為有名，且藥用價(jià)值最高。黃芪皂苷是黃芪中的重要生理活性物質(zhì)，但不同年份、不同產(chǎn)地、不同品種的黃芪中皂苷含量均不相同，導(dǎo)致市面上的黃芪質(zhì)量參差不齊，很難形成產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展[5]。如今，中藥制劑化發(fā)展迅速，把傳統(tǒng)中藥中的生理活性物質(zhì)提純后作為藥品更有利于藥劑師和醫(yī)生的精確用藥，從而更加有利于傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代化。市面上高純度的黃芪皂苷每克售價(jià)均在200元～300元，黃芪中總皂苷的含量為7.5 mg/g～17.2 mg/g，因此提純黃芪中的各種皂苷活性物質(zhì)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。一般采用的提取黃芪總皂苷的方法為回流提取法，這種方法存在提取速度慢、黃芪總皂苷含量不高、分離成本較高等缺點(diǎn)。而大孔樹(shù)脂法分離黃芪總皂苷可有效降低成本，提高提取速度和黃芪總皂苷的含量，因此對(duì)黃芪總皂苷的大孔樹(shù)脂分離純化和富集的方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究和工藝優(yōu)化。

1 材料和儀器

黃芪根（粉碎后試驗(yàn)）：山西渾源萬(wàn)生黃芪開(kāi)發(fā)有限公司；黃芪甲苷對(duì)照品（編號(hào)Z0371312）：北京譜析科技有限公司；XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101 樹(shù)脂、無(wú)水乙醇、乙酸、香草醛、高氯酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。

XFB-200型小型中藥粉碎機(jī)：吉首中誠(chéng)制藥廠；HH-3三孔三控溫水槽、T650CT雙頭恒溫超聲波提取機(jī)：上海左樂(lè)儀器有限公司；SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：西安禾普生物科技有限公司；UV-3200S紫外分光光度計(jì)：上海美國(guó)譜達(dá)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃芪總皂苷的測(cè)定

2.1.1 黃芪總皂苷的提取及檢測(cè)方法

在微量天平（千分之一）上稱取20 g黃芪粉末，按照1∶20（g/mL）加入濃度75%的乙醇溶液，將提取液置于超聲波破碎儀中（功率設(shè)置200 W），超聲助溶后，放入25℃的恒溫?fù)u床120 r/min增加其溶解效果（振蕩12 h），將提取液在定性濾紙上進(jìn)行抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至錐形瓶備用。參照文獻(xiàn)[6]的香草醛－高氯酸比色法測(cè)定黃芪總皂苷含量。

2.1.2 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇及黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用超微量天平稱取3 mg黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，按照上述方法進(jìn)行顯色反應(yīng)。以相應(yīng)的空白對(duì)照分別在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)出顯色反應(yīng)之后的最大吸收波長(zhǎng)。用移液槍量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL黃芪甲苷樣品液置于試管中，再加入95%的乙醇定容至1 mL，顯色。其中，1號(hào)試管中的溶液為空白對(duì)照。

2.2 靜態(tài)吸附和脫附試驗(yàn)

2.2.1 不同樹(shù)脂吸附解吸篩選試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101樹(shù)脂0.5 g，分別置于150 mL三角瓶中依次標(biāo)號(hào)1～7，在每個(gè)三角瓶中準(zhǔn)確加入黃芪提取液50 mL，將其轉(zhuǎn)移至恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min、25℃），將吸附后液體用于測(cè)定黃芪總皂苷含量，按如下公式計(jì)算吸附量。將飽和吸附后的各型號(hào)樹(shù)脂用去離子水清洗3遍分別置于50 mL燒杯中，用移液管準(zhǔn)確量取95%乙醇50 mL放入燒杯，解吸12 h，測(cè)出黃芪總皂苷含量，按如下公式計(jì)算解吸量和解吸率。

式中：Qe為干樹(shù)脂的吸附量，mg/g；Qd為干樹(shù)脂的解吸量，mg/g；D為解吸率，%；C0為黃酮提取液的初始濃度，mg/mL；Vi為黃酮樣品液的初始體積，mL；Ce為吸附平衡后的每毫升溶液中黃酮的濃度，mg/mL；Cd為解吸液的濃度，mg/mL；Vd為解吸液的體積，mL；W為樹(shù)脂的干重，g。

2.2.2 在所選樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)平衡的建立

將50 mL樣品溶液加入到150 mL的三角瓶中，加入提前稱重的所選大孔樹(shù)脂（等于0.5 g干樹(shù)脂）。三角瓶在搖床上以25℃，120 r/min振蕩。每隔30 min測(cè)試吸附液中黃芪總皂苷的濃度，直到達(dá)到吸附平衡，得到吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

通過(guò)偽一階和偽二階模型的適用性，預(yù)測(cè)了吸附過(guò)程中所涉及的機(jī)理。偽一階和偽二階模型可由以下數(shù)學(xué)公式表示：

式中：Qe為達(dá)到吸附平衡時(shí)每克吸附劑中溶質(zhì)的濃度，也就是吸附能力，mg/g；Qt為t時(shí)刻每克吸附劑中溶質(zhì)的濃度，mg/g；k1和k2分別是偽一階和偽二階速率常數(shù)。設(shè)定初始條件為t＝0，Qt＝0時(shí)，兩個(gè)動(dòng)力力學(xué)方程具有解吸解。如下：

2.2.3 提取液pH值影響黃芪總皂苷吸附量的試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5組0.5 g樹(shù)脂置于150 mL三角瓶中，依次標(biāo)號(hào)1～5，按照不同的pH值將黃芪總皂苷提取液加入到 1～5號(hào)錐形瓶中，pH值分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將其轉(zhuǎn)移至恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min、25℃），將吸附后液體，測(cè)出黃芪總皂苷含量。

2.2.4 黃芪總皂苷吸附模型（吸附等溫線）的測(cè)定

在千分之一天平上準(zhǔn)確稱取0.5 g干樹(shù)脂15組，轉(zhuǎn)移至三角瓶中依次標(biāo)號(hào)1～15，每3組加入相同初始濃度的黃芪提取液50 mL，將加入不同濃度樣液的三角瓶同批放入恒溫?fù)u床中振蕩吸附12 h（120 r/min），溫度分別設(shè)置為20、25、30℃，測(cè)出黃芪總皂苷含量。

2.2.5 吸附時(shí)間影響黃芪總皂苷吸附量的試驗(yàn)

在千分之一天平上準(zhǔn)確稱取0.5 g干樹(shù)脂，加入50 mL黃芪提取液置于恒溫?fù)u床中振蕩吸附（25℃，120 r/min），每隔30 min取樣0.5 mL，測(cè)出黃芪總皂苷含量。

2.3 動(dòng)態(tài)吸附和脫附試驗(yàn)

采用預(yù)處理后的水合樹(shù)脂（3 g干樹(shù)脂）進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)。

2.3.1 裝載量的優(yōu)化（動(dòng)態(tài)泄露曲線的測(cè)定）

用預(yù)處理的所選樹(shù)脂在濕式玻璃柱上裝柱，將黃芪提取液加于柱頂，研究最大裝載量。控制流速為1.0 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，測(cè)定流出的液體中黃芪總皂苷的濃度，得到動(dòng)態(tài)泄露曲線。

2.3.2 洗脫液濃度的優(yōu)化

用預(yù)處理所選樹(shù)脂在濕式玻璃柱上裝柱，用之前制備黃芪提取液逐滴上樣，用30%～90%濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫。測(cè)定流出的液體中黃芪總皂苷的濃度，選出最佳的洗脫液濃度。

2.3.3 洗脫液流速的優(yōu)化

用預(yù)處理所選樹(shù)脂在濕式玻璃柱上裝柱，用黃芪提取液上樣，取1 BV洗脫液，分別控制洗脫液流速為1.0、1.5、3.0 BV/h，測(cè)定洗脫液中黃芪總皂苷的濃度，計(jì)算解吸量。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果

提取液顯色后進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)出的最大吸收波長(zhǎng)為585 nm。橫軸為黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度值，縱軸為試驗(yàn)測(cè)定的吸光度值，用origin 8.0制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.044 2x+0.013 6（r＝0.996），式中：y為吸光度值；x為黃芪總皂苷濃度，μg/mL。此方程具有良好的線性關(guān)系。

3.2 靜態(tài)吸附和脫附試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 各型號(hào)樹(shù)脂的黃芪總皂苷吸附解吸結(jié)果

不同大孔樹(shù)脂對(duì)黃芪總皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率見(jiàn)圖1。

圖1 不同大孔樹(shù)脂對(duì)黃芪總皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率Fig.1 Adsorption capacity，dissociation capacity and dissociation rate of different macroporous resins for astragalus saponins

選擇大孔樹(shù)脂時(shí)要求樹(shù)脂對(duì)目標(biāo)皂苷吸附容量大、選擇性高、吸附速率快、解吸容易并且再生容易。吸附容量和吸附速率可采用靜態(tài)吸附法確定各型號(hào)樹(shù)脂吸附和解吸黃芪總皂苷的含量及解吸率[7]。如圖1所示，從吸附效果和解吸效果來(lái)看，XDA-4樹(shù)脂都明顯好于其它樹(shù)脂，故選用XDA-4型樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2.2 黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)

黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，擬一階動(dòng)力學(xué)模型和擬二階動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)線形圖見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，擬一階動(dòng)力學(xué)模型和擬二階動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)線形圖Fig.2 The adsorption kinetics curve of astragalus saponins on XDA-4 resin and the correlation line graph of the pseudo-firstorder kinetics model and the pseudo-second-order kinetics model

接觸時(shí)間是決定吸附行為的另一個(gè)重要因素。為了評(píng)價(jià)接觸時(shí)間對(duì)吸附性能的影響，得到了黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線（圖2a）。大孔樹(shù)脂對(duì)皂苷類成分吸附速率的快慢可以通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)測(cè)定。黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附量在初始的240 min隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增長(zhǎng)，在250 min后達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。因此在后續(xù)試驗(yàn)中采用240 min的吸附時(shí)間較為合適。

參照文獻(xiàn)中試驗(yàn)常采用假一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程或假二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合[8]。大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附過(guò)程可以采用General rate model（GR模型）[9]。該模型考慮了各種影響色譜傳質(zhì)的因素，具有普適性，但是形式較為復(fù)雜。因未有色譜精制皂苷類成分的數(shù)學(xué)建模研究，本研究比較了Guiochon等綜述的多種GR模型的簡(jiǎn)化形式[10]，最終選擇了“l(fā)g（Qe-Qt）與t”和“t/Qt與t”的關(guān)系曲線?！發(fā)g（Qe-Qt）與t”和“t/Qt與t”的關(guān)系曲線如圖2b和2c所示，從這些曲線的斜率計(jì)算出k1和k2的值，用擬二階動(dòng)力學(xué)模型解釋了黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂的吸附情況，得出黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力模型如下：

擬一階動(dòng)力學(xué)方程：

t/Qe=7.046 83t+0.687 1，R2=0.882 89

擬二階動(dòng)力學(xué)方程：

lg（Qe-Qt）=-0.0418t+1.090 93，R2=0.984 2

3.2.3 提取液pH值對(duì)吸附量的影響

上樣時(shí)樣品的pH值是決定吸附行為的一個(gè)重要因素，為了解上樣時(shí)pH值對(duì)吸附性能的影響，得到了黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的吸附量隨pH值的變化，見(jiàn)圖3。

圖3 XDA-4樹(shù)脂在不同pH值條件下對(duì)黃芪總皂苷的吸附能力Fig.3 Adsorption capacity of XDA-4 resin on astragalus saponins at different pH values

如圖3所示，pH值從5.0上升至7.0的過(guò)程中吸附量明顯上升，但隨著pH值的繼續(xù)上升吸附量卻急劇下降，因此選擇接近中性的樣液進(jìn)行上樣比較合適。黃芪提取液的初始pH值為7.06，因此，在上樣過(guò)程中無(wú)需調(diào)整pH值。

3.2.4 黃芪總皂苷在XDA-4上的吸附模型（吸附等溫線）的建立

對(duì)于不同樹(shù)脂和藥液使用Langmuir方程或Freundlich方程擬合結(jié)果的優(yōu)劣可能不同[9]。為了選出最佳的上樣條件，建立了Langmuir等溫線和Freundlich等溫線，見(jiàn)表1。吸附等溫線見(jiàn)圖4。

表1 不同溫度下黃芪總皂苷在XDA-4大孔樹(shù)脂上的Langmuir方程和Freundlich方程Table 1 Langmuir isotherm and Freundlich isotherm of the adsorption capacity curve of astragalus saponins on XDA-4 resin at different temperture

經(jīng)過(guò)建立吸附模型，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)在20℃下，上樣濃度為0.72 mg/mL吸附效果最好。

3.3 動(dòng)態(tài)吸附和脫附試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 裝載量的優(yōu)化結(jié)果

黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)泄露曲線見(jiàn)圖5。

圖4 黃芪總皂苷在20、25、30℃XDA-4樹(shù)脂上的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms for total astragalus saponins on XDA-4 resin at 20，25，30℃

圖5 黃芪總皂苷在XDA-4樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)泄露曲線Fig.5 Dynamic leakage curve of astragalus saponins on XDA-4 resin

如圖5所示，隨著黃芪提取液裝柱體積的增加，流出液中的黃芪總皂苷的濃度也在不斷的增加，吸附率會(huì)逐漸降低，當(dāng)流出液收集到80 mL的時(shí)候洗脫液中黃芪總皂苷的濃度迅速增加，表明此時(shí)已經(jīng)達(dá)到泄漏點(diǎn)。因此，選擇上樣體積為80 mL。

3.3.2 洗脫液濃度的優(yōu)化結(jié)果

洗脫液濃度初步優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同濃度乙醇溶液對(duì)XDA-4樹(shù)脂洗脫能力的影響Fig.6 Effect of different ratio of ethanol solution on elution capacity on XDA-4 resin

圖6表明，當(dāng)乙醇濃度小于40%，對(duì)黃芪總皂苷的洗脫能力很弱，乙醇濃度在40%～80%之間，對(duì)黃芪總皂苷的洗脫能力隨著乙醇濃度的升高而提升，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，黃芪總皂苷在乙醇洗脫液中的濃度明顯提高，且在優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，分不同濃度乙醇洗脫，可以在皂苷損失很少的情況下除去更多雜質(zhì)，而乙醇比例達(dá)到80%之前，洗脫能力明顯提高，80%之后洗脫能力變化不大，選擇80%乙醇為最佳洗脫劑。所以，在后續(xù)的常規(guī)優(yōu)化過(guò)程中先選用40%～60%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再使用80%乙醇洗脫，富集高濃度黃芪總皂苷。這一結(jié)果與杜海勝等[11]用HPD400-A樹(shù)脂純化胡蘆巴總皂苷類似，水洗滌之后采用低體積分?jǐn)?shù)乙醇（30%）進(jìn)行第2次洗滌，在皂苷損失很少的情況下除去更多雜質(zhì)。

3.3.3 洗脫流速優(yōu)化結(jié)果

累積解吸率隨解吸液體積變化曲線和累積解吸率隨時(shí)間變化曲線見(jiàn)圖7。

圖7 累積解吸率隨解吸液體積變化曲線和累積解吸率隨時(shí)間變化曲線Fig.7 Curve of cumulative dissociation rate with dissociated liquid product and curve of cumulative dissociation rate with time

為了有效地從樹(shù)脂中解吸出黃芪總皂苷，一個(gè)合適的流速十分必要，Yamamoto等[12]線性增加的解吸劑能增加不同成分的分離度。解吸流速的選擇需要綜合考慮解吸劑消耗和時(shí)間消耗，F(xiàn)u等[13]研究結(jié)果表明，較低的解吸流速可以減少解吸劑用量，但消耗的時(shí)間明顯增加。從圖7可以看出，當(dāng)洗脫劑流速在1 BV/h和1.5 BV/h時(shí)，洗脫液中黃芪總皂苷的濃度較高。隨著流速增快，解吸率明顯下降，因此選擇洗脫流速為1.5 BV/h較為合適。

4 結(jié)論和討論

本試驗(yàn)前期進(jìn)行了靜態(tài)吸附試驗(yàn)和靜態(tài)解吸試驗(yàn)，優(yōu)選了樹(shù)脂型號(hào)、吸附溫度、吸附時(shí)間、上樣pH值等參數(shù)，進(jìn)一步進(jìn)行吸附/脫附試驗(yàn)，優(yōu)化洗脫液濃度、脫附流量。XDA-4型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪中黃芪總皂苷吸附和分離性能最強(qiáng)，通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)分析和吸附模型的建立，得出其最佳工藝為：黃芪提取液中的黃芪總皂苷的濃度控制在0.72 mg/mL，無(wú)需額外調(diào)節(jié)其pH值，上樣體積為80 mL，吸附時(shí)間不少于240 min，80%乙醇以1.5 BV/h的速度進(jìn)行洗脫。

Wan等[14]用 DS-401樹(shù)脂精制三七皂苷，先用30%乙醇解吸人參三醇型皂苷，再用80%乙醇解吸人參二醇型皂苷，實(shí)現(xiàn)了兩大類皂苷的分離。本研究中未涉及分步實(shí)現(xiàn)多種黃芪皂苷的同步分離，在本研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將繼續(xù)精細(xì)大孔樹(shù)脂的分離工藝，期望實(shí)現(xiàn)同步分批多類型黃芪皂苷的分離。

在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在保持樹(shù)脂干重相同的情況下，裝柱后測(cè)得的裝床體積每次都有不同程度的變化。查閱資料后發(fā)現(xiàn)活化大孔樹(shù)脂時(shí)乙醇的濃度、活化時(shí)的溫度、活化時(shí)間都對(duì)大孔樹(shù)脂的膨脹率有明顯影響。因此，在之后的活化過(guò)程中將乙醇濃度固定在80%，置于20℃的恒溫?fù)u床中活化4 h，之后的柱床體積基本保持不變。在動(dòng)態(tài)吸附的研究過(guò)程中，上樣完成后用6倍柱床體積的去離子水洗去未吸附的提取液后，發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂出現(xiàn)漂浮的情況并且柱床中出現(xiàn)了零零散散的氣泡?？紤]到經(jīng)過(guò)乙醇活化后的大孔樹(shù)脂密度明顯低于水的密度才會(huì)出現(xiàn)這種情況，因此在之后的清洗過(guò)程中先逐滴加入去離子水，待不再出現(xiàn)大孔樹(shù)脂大量漂浮的情況后再大量加入去離子水。而柱床中出現(xiàn)氣泡的情況可能是由于去離子水流速過(guò)快導(dǎo)致，在之后的清洗過(guò)程中降低去離子水的流速，并用吸耳球不斷敲擊層析柱使氣泡分離出去，之后便不再出現(xiàn)這種情況。在試驗(yàn)中為節(jié)約大孔樹(shù)脂，所使用過(guò)的樹(shù)脂都應(yīng)該進(jìn)行再生[15]后重復(fù)利用。

黃芪總皂苷含量較低，各產(chǎn)地藥材間差別較大[16]，質(zhì)量控制較為困難，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂分離方法優(yōu)化可有效解決以上問(wèn)題。大孔樹(shù)脂層析法處理后黃芪總皂苷濃度明顯提高，該方法有無(wú)毒、成本低、高效、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。