（遼東學(xué)院城市建設(shè)學(xué)院，遼寧丹東118003）

中國啤酒市場呈現(xiàn)高端化的發(fā)展趨勢，精釀啤酒增長顯著[1]，精釀啤酒發(fā)酵后的酒渣含水率和有機(jī)物含量較高，極易在較短時間內(nèi)腐爛發(fā)臭，帶來環(huán)境污染[2]。近年來，世界各國的藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，我國年產(chǎn)量達(dá)到28 000 t，可占全球的4.3%[3]。藍(lán)莓產(chǎn)品層出不窮，涌現(xiàn)出大量的果汁類產(chǎn)品，同時也產(chǎn)生了大量藍(lán)莓廢棄果渣。研究顯示，藍(lán)莓果渣中的不溶性膳食纖維、礦物質(zhì)及微量元素含量都高于鮮果且富含花青素等抗氧化物質(zhì)[4-5]。

中國是世界上最大的養(yǎng)殖生產(chǎn)國之一，隨著養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)的飼料資源已不能滿足迅猛增長的飼料市場，特別是蛋白質(zhì)飼料原料的缺乏[6-7]已成為阻礙我國畜牧、養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的突出問題。研究已證實運用微生物多菌種混合發(fā)酵技術(shù)可以降低纖維素含量，顯著提高飼料中蛋白質(zhì)含量，從而提高動物消化率[8-10]。精釀啤酒糟較啤酒糟富有更多的蛋白和纖維，但糖類含量偏低，藍(lán)莓果渣富含糖類，二者結(jié)合可取長補(bǔ)短。鑒于精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣中粗纖維含量較高而纖維素可阻礙飼料中營養(yǎng)成分的吸收，因此利用從高溫堆肥中優(yōu)化培養(yǎng)的普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）具有較強(qiáng)纖維素的降解能力先進(jìn)行第一次發(fā)酵，有利于將原料中的纖維素分解為可利用的糖類物質(zhì)，利用白地霉（Geotrichum candidum）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的混合菌進(jìn)行二次發(fā)酵獲得高含量的飼料蛋白。

響應(yīng)曲面法是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的試驗設(shè)計方法[11]，不但具有周期短，精度高，試驗次數(shù)少等優(yōu)點[12]，而且可優(yōu)化和評價試驗指標(biāo)的各因子水平及交互作用，快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[13]。本文選用普通高溫放線菌、白地霉和植物乳桿菌的混合菌種為發(fā)酵菌種，以精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣為主料，麩皮為輔料利用響應(yīng)面優(yōu)化法，優(yōu)化精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣混合發(fā)酵制備蛋白飼料的發(fā)酵工藝參數(shù)，旨在為精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 原料

精釀啤酒糟：丹東啤V8精釀啤酒生產(chǎn)基地；藍(lán)莓果渣：丹東幸福食品有限公司；麩皮：河北靈壽縣達(dá)業(yè)礦產(chǎn)品加工廠。

1.2 菌種及來源

普通高溫放線菌（菌株保藏編號：CICC 10672，拉丁名稱：Thermoactinomyces vulgaris）、白地霉（菌株保藏編號：CICC 1443，拉丁名稱：Geotrichum candidum）、植物乳桿菌（菌株保藏編號：CICC 21794，拉丁名稱：Lactobacillus plantarum）、黑曲霉（菌株保藏編號：CICC 2103，拉丁名稱：Aspergillus niger）、綠色木霉（菌株保藏編號：CICC13002，拉丁名稱：Trichoderma viride）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計（SP-756P）：上海光譜儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070MBE）：上海博訊醫(yī)療設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌器（LX-B100L）：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1F）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床（QYC-2112）：上海?，斣O(shè)備有限公司；光照培養(yǎng)箱（GTOP-268Y）：浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

普通高溫放線菌培養(yǎng)基為葡萄糖4.0 g、酵母膏4.0 g、麥芽提取物10.0 g、CaCO32.0 g、蒸餾水1.0 L、pH7.2；白地霉、綠色木霉和黑曲霉培養(yǎng)基為5°Bé麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，其制備步驟為：稱取50g干麥芽磨碎后加入400 mL蒸餾水，在50℃～60℃水浴鍋中糖化3 h～4 h，完全煮沸。將煮沸的糖化液用4層～6層紗布過濾，然后將濾液裝入塑料離心灌中，離心機(jī)離心，4 000 r/min，離心10 min，取上清液。將麥芽汁上清液稀釋到 5°Bé～6°Bé，pH 值約為 6.4。植物乳桿菌斜面培養(yǎng)基制備步驟：稱取酪蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、Tween 80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO320.0 g，加入蒸餾水1.0 L煮沸溶化，調(diào)整pH值為5.0。根據(jù)上述培養(yǎng)基配方配好培養(yǎng)基后，121℃下滅菌30 min，待用。斜面固體培養(yǎng)基只需加入適量瓊脂即可。

1.5 分析方法

粗纖維含量測定參照GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》；真蛋白含量測定參照王文芹等的方法[14]。

1.6 試驗方法

1.6.1 粗纖維降解能力的菌種篩選

先將精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣按質(zhì)量比1∶1比例混合，二者混合物和麩皮再以質(zhì)量比4∶1比例混合制成發(fā)酵培養(yǎng)基并測定粗纖維含量；將普通高溫放線菌、黑曲霉和綠色木霉經(jīng)斜面固體、液體培養(yǎng)后制成種子液；在250 mL三角瓶中加入發(fā)酵培養(yǎng)基30 g，加入0.8倍蒸餾水，在121℃滅菌20 min后，分別接入20%的普通高溫放線菌、綠色木霉和黑曲霉種子液，分別在50℃和30℃溫度下培養(yǎng)72 h。

1.6.2 Plackett-Burman設(shè)計

選取影響發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的可能因素，對白地霉和植物乳桿菌混合菌的發(fā)酵時間、菌種比、接種量、精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的比值、精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的混合量和麩皮量6個因素進(jìn)行全面考察，選用Plackett-Burman設(shè)計，每個因素取2個水平，真蛋白含量作為響應(yīng)值，考察各因素的主效應(yīng)和交互作用，確定重要影響因素。設(shè)計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素及水平Table 1 Plackett-Burman design factors and levels

1.6.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，對Plackett-Burman設(shè)計篩選的3個主要影響因素進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗纖維降解能力的菌種比較

粗纖維降解能力的菌種比較見圖1。

圖1 粗纖維降解能力的菌種比較Fig.1 Comparison of bacteria in degradation ability of crude fibe

圖1中可以看出，3種菌降解粗纖維的能力都較強(qiáng)，普通高溫放線菌>黑曲霉>綠色木霉，因此普通高溫放線菌的降解能力最強(qiáng)。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

試驗結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)帕累托圖見圖2。

表2的試驗結(jié)果和圖2的標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)帕累托圖顯示，精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的混合量、精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的質(zhì)量比和麩皮量是3個最重要的影響因素。發(fā)酵時間、菌種比和接種量雖然不是最重要影響因素，但后續(xù)的發(fā)酵將采取中間值進(jìn)行即發(fā)酵時間為3 d，白地霉和植物乳桿菌的菌種按質(zhì)量比為4∶1，接種量為5%。

表2 試驗結(jié)果Table 2 Experimental results

圖2 標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)帕累托圖Fig.2 Pareto chart of the standardized effects

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗方案及試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，對Plackett-Burman設(shè)計篩選的3個主要影響因素進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計，各因素的取值水平如表3所示，試驗結(jié)果如表4所示，響應(yīng)面的回歸模型和方差分析如表5所示。

表3 主要影響因素及水平Table 3 Main influencing factors and levels

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 4 Experimental results of response surface

表5 響應(yīng)面的回歸模型和方差分析Table 5 Regression model and variance analysis of response surface

通過Design-Expert8.0.5.0軟件對表5統(tǒng)計進(jìn)行多元回歸擬合，得到精釀啤酒糟和藍(lán)莓的質(zhì)量比，精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的混合量和麩皮量的二元多項回歸方程為Y=44.07+1.80A+2.56B+1.64C+0.240 00AB-0.14AC-0.15BC-4.17A2-4.66B2-3.52C2。Y為真蛋白含量，A為精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的質(zhì)量比，B為精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的混合量，C為麩皮量。通過比較方程中一次系數(shù)的絕對值大小，可以直接判斷因子影響的主次性[15]。從回歸方程可知，精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的混合量對發(fā)酵之后的真蛋白含量影響最大，其次是精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的質(zhì)量比，最后是麩皮量。

由表5可知，模型的F=32.53 P<0.0001，證明模型極顯著，失擬項F=0.94，P=0.501 4>0.05表明失擬不顯著，二元多項回歸方程擬合效果良好[16]。在回歸模型中，一次項 A、B、C，二次項 A2、B2、C2對響應(yīng)值 Y 影響極顯著（P<0.01），而因素間的交互項顯著性較差，表明3個因素對真蛋白含量均存在顯著影響，其關(guān)系是一種非線性關(guān)系[17-18]。模型決定系數(shù)R2=0.976 6，說明該模型可以解釋97.66%的試驗，方程的擬合度較高。CV代表離散系數(shù)可表示試驗的精確度，其值越低，試驗可靠性越高，本試驗的CV=2.82%說明試驗操作可信度較高[19]，信噪比為15.621，遠(yuǎn)大于4，說明該模型擬合度和可信度均較高[20]模型可用于精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣混合發(fā)酵的條件分析和預(yù)測。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert8.0.5.0軟件制作的響應(yīng)面圖來反映各個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系和兩個因素間交互作用的類型，通過等高線圖反映各因素間交互作用的顯著程度。響應(yīng)面坡度陡峭，等高線呈橢圓形或扁平狀表示交互作用顯著，響應(yīng)面坡度平緩，等高線呈圓形表示交互作用不顯著[19]。3種因素交互作用時真蛋白含量的影響的曲面圖見圖3。

圖3直觀地反映各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，精釀啤酒糟和藍(lán)莓的質(zhì)量比（A）和麩皮量（C）對真蛋白含量的響應(yīng)曲面坡度相對陡峭，表明其對響應(yīng)值的交互作用相對明顯。

圖3 各因素交互作用對真蛋白含量影響的曲面圖Fig.3 Surface diagram of interaction of various factors on true protein content

由回歸模型分析可知，最佳發(fā)酵優(yōu)化條件是精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的質(zhì)量比值為1.42∶1，精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的混合量是87.66%，麩皮量為9.9%，真蛋白含量為40.15%。

2.3.3 驗證試驗

為檢驗試驗的可靠性，利用上述預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行驗證試驗，3次平行試驗的結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量為40.14%，與預(yù)測值非常接近。說明模型準(zhǔn)確性高，能較好反映各參數(shù)對產(chǎn)物真蛋白含量的影響。

3 結(jié)論

本試驗中精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣的混合物先通過普通高溫放線菌進(jìn)行第一次發(fā)酵以降解粗纖維，再通過白地霉和植物乳桿菌的混合菌進(jìn)行二次發(fā)酵制得飼料蛋白。普通高溫放線菌第一次發(fā)酵后粗纖維含量由原來的23.7%降為7.9%，在Plackett-Burman設(shè)計的基礎(chǔ)上，確定二次發(fā)酵的3個最重要影響因素，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到了二次發(fā)酵的最佳發(fā)酵優(yōu)化條件，試驗結(jié)果表明，當(dāng)精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的質(zhì)量比值為1.42∶1，精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣的混合量是87.66%，麩皮量為9.9%，白地霉和植物乳桿菌的質(zhì)量比為4∶1，最佳接種量為5%時，真蛋白含量可達(dá)40.15%。3個最重要因素對真蛋白含量影響的程度依次為精釀啤酒糟和藍(lán)莓的混合量>精釀啤酒糟和藍(lán)莓質(zhì)量比>麩皮量。本研究通過微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)將兩種營養(yǎng)豐富的精釀啤酒糟和藍(lán)莓渣進(jìn)行混合發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料不僅可以充分利用兩種廢渣中的營養(yǎng)成分而且可以降低因精釀啤酒糟和藍(lán)莓果渣利用困難而造成的資源浪費和環(huán)境污染。