劉小芳，顏征，冷凱良，2，*，孫如男，3，于源，苗鈞魁

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島266200；3.青島大學(xué)藥學(xué)院，山東青島266021）

南極磷蝦（Euphausia superba）又名大磷蝦或南極大磷蝦，是一種生活在南極海域的小型甲殼類浮游動(dòng)物[1]。南極磷蝦資源蘊(yùn)藏量巨大，生物量達(dá)到6.5億噸～10億噸，具有成為我國第二個(gè)遠(yuǎn)洋漁業(yè)的巨大潛力[2-3]。南極磷蝦中蛋白質(zhì)含量豐富，約達(dá)到11.9%～16.3%（鮮基），且富含人體所需的多種必需氨基酸，是極具開發(fā)價(jià)值的海洋優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[1，4]，但目前尚未得到充分利用。研究明確南極磷蝦蛋白的生物活性，精準(zhǔn)定位應(yīng)用領(lǐng)域，是提高南極磷蝦蛋白資源利用率和促進(jìn)南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

近年來，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道多肽具有良好的生物活性，如抑菌、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、改善骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)心血管等[2，4，5-9]。因此，富含活性多肽的產(chǎn)品受到消費(fèi)者的廣泛喜愛，多肽被應(yīng)用于食品、藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域，具有良好的市場(chǎng)前景。常用的多肽提取方法有溶劑提取法、酶解提取法、超聲輔助提取法[10]，但存在多肽得率低、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。近年來，為克服這些缺點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了超聲輔助酶解、亞臨界水提取、雙酶法酶解等方法[11-14]，具有水解效果佳、肽得率高和活性好的優(yōu)點(diǎn)。本文采用堿溶酸沉法與酶解法聯(lián)用的技術(shù)制備南極磷蝦多肽，初步分析多肽的組成及結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)評(píng)價(jià)其體外抗氧化和降血壓活性，以期為南極磷蝦蛋白資源的高效利用提供理論依據(jù)，為南極磷蝦多肽在相關(guān)領(lǐng)域的精準(zhǔn)應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦凍蝦：由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所“南極海洋生物資源開發(fā)與利用”項(xiàng)目組提供，打漿，攪拌均勻，保存于-80℃待用。

Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ABTS、透析袋：北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE，≥10 U/mg）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-L-苯丙酰胺-甘氨酸-甘氨酸{N-[3-（2-Furyl）acryloyl]-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG}：Sigma-Aldrich公司；4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸 [4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES]、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸（分析級(jí)）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST3100型pH計(jì)：奧斯豪（常州）儀器有限公司；UV1102Ⅱ型紫外/可見分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；CTFD-10P型冷凍干燥機(jī)：青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、SHA-B型恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；BAS224S-CW型電子天平：賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；Neofuge 15R型高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦蛋白的提取

采用堿溶酸沉法[15]（兩次堿溶、兩步酸沉）分離蛋白：稱取一定量的南極磷蝦蝦漿，加入蒸餾水[水料比6 ∶1（mL/g）]，攪拌均勻，調(diào)節(jié) pH 值至 11.5，4 ℃攪拌浸提 30 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到上層液體A和沉淀A。將沉淀A進(jìn)行二次堿溶，水料比為3 ∶1（mL/g），調(diào)節(jié) pH 值至 11.5，4 ℃攪拌浸提 30 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到上層液體B和沉淀B。將液體A和液體B混合得到液體C，將液體C的pH值調(diào)至 5.5，靜置 20 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀D和上層液體D，將液體D的pH值調(diào)至4.6，靜置 20 min，離心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀 E，合并沉淀D和沉淀E，透析脫除鹽和單糖等物質(zhì)，冷凍干燥即得南極磷蝦蛋白。

1.3.2 南極磷蝦多肽的制備

采用堿性蛋白酶酶解制備多肽[13]：稱取一定質(zhì)量的南極磷蝦蛋白（1.3.1）分散于蒸餾水中[水料比25∶1（mL/g）]，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至9.0，50℃水浴15 min（預(yù)熱），加入堿性蛋白酶（6 000 U/g）酶解1 h（酶解溫度50℃，水浴振蕩速度150 r/min），100℃滅酶15 min，冷卻至室溫（25℃），將 pH 值調(diào)至 4.0，離心（5 000 r/min，30 min）收集上清液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，抽濾后經(jīng)正己烷對(duì)酶解液脫脂，冷凍干燥即得南極磷蝦多肽。

1.3.3 總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法的規(guī)定執(zhí)行。

1.3.4 水解度的測(cè)定

水解度為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量與總氮含量的比值。氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中酸度計(jì)法的規(guī)定執(zhí)行?？偟康臏y(cè)定按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法的規(guī)定執(zhí)行。

1.3.5 多肽得率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測(cè)定：將酶解液（稀釋數(shù)倍）與等體積的10%的三氯乙酸混合，30℃水浴30min，然后5 000 r/min離心10 min，除去大分子蛋白質(zhì)。采用Lowry法測(cè)定多肽濃度，多肽得率按下式計(jì)算：

1.3.6 多肽的紫外-可見光譜（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）檢測(cè)

稱取5mg多肽粉末（1.3.2）溶于10mL蒸餾水，采用紫外-可見分光光度計(jì)在230 nm～400 nm進(jìn)行掃描[14]。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)T-IR）檢測(cè)

采用傅里葉變換紅外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，記錄500 cm-1至4 000 cm-1范圍內(nèi)樣品的FT-IR光譜[14]。

1.3.8 多肽分子量測(cè)定

按照GB 31645-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白肽》中附錄A規(guī)定的方法執(zhí)行。

1.3.9 多肽氨基酸組成分析

按照GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》的規(guī)定執(zhí)行。

1.3.10 多肽的還原力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測(cè)定：1.5 mL多肽樣品溶液中加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）和1.5 mL鐵氰化鉀溶液（1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），混勻，50℃水浴20 min，加入0.75 mL三氯乙酸溶液（10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），4 000 r/min離心10 min。取1.5 mL上層清液與0.3 mL三氯化鐵溶液（0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），1.5 mL蒸餾水混勻，室溫（25℃）靜置10 min，在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，吸光值越大還原能力越強(qiáng)。

1.3.11 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13-14]的方法進(jìn)行測(cè)定：2 mL多肽樣品溶液中加入2mLDPPH乙醇溶液（0.2mmol/L），混勻，室溫（25℃）避光靜置30min，離心（3500r/min，10min），在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。DPPH·清除率的計(jì)算公式為：

式中：A0為對(duì)照組吸光值；Ai為樣品組吸光值；Aj為空白組吸光值。

1.3.12 清除ABTS+自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行測(cè)定：將0.4 mL的樣品溶液與3.6 mL ABTS溶液混合，室溫（25℃）下避光反應(yīng)5 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。ABTS+自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：B0為對(duì)照組吸光值；Bi為樣品組吸光值；Bj為空白組吸光值。

1.3.13 清除羥自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測(cè)定：在1 mL多肽樣品溶液中依次加入0.5 mL硫酸亞鐵（9 mmol/L），1 mL的水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL雙氧水（4.4 mmol/L）和2 mL蒸餾水，37℃水浴1 h，4 000 r/min離心15 min，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值?！H清除率的計(jì)算公式如下：

式中：C0為對(duì)照組吸光值；Ci為樣品組吸光值；Cj為不加雙氧水的樣品吸光值。

1.3.14 ACE抑制活性

參照文獻(xiàn)[19-20]的方法進(jìn)行測(cè)定。按表1所示，依次添加各反應(yīng)組分，在37℃下溫育30 min，在340 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定各孔在0、30 min的吸光值。

表1 南極磷蝦多肽的ACE抑制活性測(cè)定Table 1 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

ACE抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：A為對(duì)照孔吸光值的減少值；B為樣品孔吸光值的減少值。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度和肽得率

采用堿溶酸沉法和酶解法聯(lián)用制備南極磷蝦多肽，具有較好的水解度和多肽得率，分別達(dá)到（17.83±3.73）%和（57.20±0.24）%。劉璐等[21]采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解制備南極磷蝦多肽的工藝，在最佳條件下，水解度略高于本研究，但酶解時(shí)間是本研究的5倍。張?jiān)萚22]采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化南極磷蝦多肽的酶解制備工藝，水解度為12.88%，低于本研究結(jié)果。

2.2 紫外-可見吸收光譜

南極磷蝦多肽的紫外-可見吸收光譜如圖1所示，南極磷蝦多肽的特征吸收波長(zhǎng)范圍在270 nm～280 nm，最大特征吸收波長(zhǎng)為273.5 nm。

圖1 南極磷蝦多肽的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectra of the Antarctic krill polypeptides

2.3 FT-IR光譜

南極磷蝦多肽的傅里葉變換紅外光譜如圖2所示。

圖2 南極磷蝦多肽的FT-IR光譜Fig.2 FT-IR spectra of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有多肽的特征吸收峰[23]，在3 390.84 cm-1處有N-H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰（酰胺A帶），在2 917.66 cm-1處有C-N伸縮振動(dòng)的特征吸收峰（酰胺B帶）[23-24]，在 1 648.36 cm-1有C＝O伸縮振動(dòng)所引起的特征吸收峰（酰胺I帶），1 547.59 cm-1處的特征吸收峰歸屬于酰胺II帶，在1 402.21 cm-1處有C＝O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)所引起的吸收峰（酰胺III帶）[14，25-27]。

2.4 多肽的分子量分布

南極磷蝦多肽的分子量分布如圖3所示。

圖3 南極磷蝦多肽的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽的分子量主要在189 Da～6500 Da，符合生物活性肽分子量分布范圍[28]，其中，451 Da～1 450 Da占比最高（41.00±0.05）%。劉云姣等[29]使用胰蛋白酶酶解制備南極磷蝦多肽，采用凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)多肽分子量主要集中分布在5 kDa以下，與本研究結(jié)果相似。

2.5 多肽的氨基酸組成分析

南極磷蝦多肽的氨基酸組成與含量如表2所示。

南極磷蝦多肽共檢出17種氨基酸，含有7種必需氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，占總氨基酸含量的14.00%，天冬氨酸含量次之，占總氨基酸含量的11.76%。必需氨基酸占比為40.32%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為67.56%，均符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（必需氨基酸占氨基酸總量的40%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為60%），說明南極磷蝦多肽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值良好，符合理想模式[30-31]。

表2 南極磷蝦多肽的氨基酸組成與含量Table 2 Amino acid compositions of the Antarctic krill polypeptides

2.6 多肽的還原能力

南極磷蝦多肽的還原能力如圖4所示。

圖4 南極磷蝦多肽的還原能力Fig.4 Reducing power of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有顯著的還原能力。隨著多肽濃度增大，吸光值增大，說明還原能力越來越強(qiáng)，與史亞萍等[32]的研究具有相同的趨勢(shì)。Ambigaipalan等[33]從蝦殼加工廢棄物中制備多肽，也具有顯著的還原能力。

2.7 多肽清除DPPH自由基能力

南極磷蝦多肽清除DPPH·的能力如圖5所示。

圖5 南極磷蝦多肽的DPPH·清除活性Fig.5 DPPH·scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽濃度為1 mg/mL～8 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率為（16.87±3.81）% ～（60.73±1.50）%。隨著多肽濃度的升高，清除能力增強(qiáng)，與張?jiān)萚22]的研究結(jié)果一致，但本研究所制備的南極磷蝦多肽的清除DPPH·的能力更強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算，南極磷蝦多肽清除DPPH·的 IC50值為 5.65 mg/mL。

2.8 多肽清除ABTS+自由基

南極磷蝦多肽清除ABTS+自由基的能力如圖6所示。

圖6 南極磷蝦多肽的ABTS+自由基清除活性Fig.6 ABTS+scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽以濃度依賴的方式清除ABTS+自由基，清除能力顯著。當(dāng)多肽濃度為2 mg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除率達(dá)到（93.81±0.10）%。經(jīng)計(jì)算，南極磷蝦多肽清除ABTS+自由基的IC50值為0.17 mg/mL。與牛脊髓肽[18]、烏賊墨多肽[34]和豬腦水解肽[35]相比，南極磷蝦多肽具有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基能力，說明南極磷蝦是多肽類抗氧化劑的良好來源。

2.9 多肽清除羥自由基

南極磷蝦多肽清除·OH的能力如圖7所示。

隨著南極磷蝦多肽濃度的增加，·OH清除率逐漸提高，當(dāng)多肽濃度為10 mg/mL時(shí)，·OH清除率達(dá)到（96.22±3.50）%。經(jīng)計(jì)算，南極磷蝦多肽清除·OH的IC50值為4.46 mg/mL。

圖7 南極磷蝦多肽的·OH清除活性Fig.7·OH scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

2.10 多肽的ACE抑制活性

南極磷蝦多肽的ACE抑制活性見圖8。

圖8 南極磷蝦多肽的ACE抑制活性Fig.8 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

南極磷蝦多肽具有顯著且良好的抑制ACE的能力，隨著多肽濃度增大，多肽抑制ACE的能力增強(qiáng)。當(dāng)多肽濃度為0.5 mg/mL時(shí)，ACE抑制率為（55.91±2.63）%。高穎等[36]通過研究發(fā)現(xiàn)低氟南極磷蝦肽也具有良好的抑制ACE活性；Zhao等[7]采用超濾法和色譜法從南極磷蝦蛋白水解物中分離出8種降血壓肽，特別是Trp-Phe和Phe-Ala-Ser對(duì)ACE表現(xiàn)出明顯的抑制活性；以上研究結(jié)果說明南極磷蝦是多肽類降血壓劑的良好來源。

3 結(jié)論

本文采用堿溶酸沉（兩步堿溶、兩步酸沉）與堿性蛋白酶酶解聯(lián)用法制備南極磷蝦多肽，具有較好的水解效果和較高的肽得率，所得多肽的分子量≤6 500 Da（98.93%），氨基酸組成理想，且多肽呈現(xiàn)良好的抗氧化活性和ACE抑制活性，南極磷蝦是制備多肽類抗氧化劑和降血壓劑的良好原料。未來研究可對(duì)獲得的南極磷蝦多肽進(jìn)一步分離純化，篩選得到活性最優(yōu)組分，并解析其構(gòu)效關(guān)系，開發(fā)出具有特定功效的活性肽產(chǎn)品。本研究可為南極磷蝦多肽在相關(guān)領(lǐng)域的精準(zhǔn)應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)，推動(dòng)南極磷蝦資源的高效高質(zhì)利用。