李學玲，許苑南，龍佳敏，張建強，陳梅，*

（1.云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南昆明650504；2.普洱學院生物與化學學院，云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南普洱665000）

黃果茄（Solanum xanthocarpum Schrad.et Wendl）為茄科、茄屬植物，是多年生野生植物。主要分布于我國的福建、海南、廣西、四川、云南等地，黃果茄的果實、種子及根均可入藥，具有清熱利濕、活血化瘀和止痛的功效。目前，國內(nèi)外對黃果茄總黃酮的提取工藝及體外抗氧化活性的研究鮮見報道。

閆曉慧等[1]采用甲醇回流的方法得到黃果茄提取物，對其進行了抗煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）活性研究，結果顯示具有一定的抗病毒活性，因此推測黃果茄中可能含有抗TMV的活性物質；徐興建等[2]通過探究黃果茄提取物對不同貝類的生物效應，表明黃果茄提取物是一種劑量低、效果好且很有潛力的植物滅螺劑；魏風華等[3]通過一系列試驗，探究黃果茄提取物的滅螺效果，并進行了魚類和大鼠急性毒性實驗，得出黃果茄提取物是一種劑量低、效果好且對魚類和大鼠毒性較低的植物滅螺劑；李娟娟等[4]提取和分離了黃果茄果實原粉中有效成分，得出黃果茄果實原粉中含有生物堿，它能有效抑制并殺死釘螺并且對魚類毒性不大，是一種效果好且低毒的滅螺劑；余蔚等[5]采用正交試驗法，以黃果茄果實中生物堿的質量分數(shù)為考察指標，優(yōu)化黃果茄果實中生物堿的提取工藝條件。

Josekutty等[6]研究發(fā)現(xiàn)從黃果茄中提取的有效成分對貓、犬的心肌有增強收縮作用；Dewangan等[7]用乙醇浸提黃果茄果實得到的提取物中被鑒定出重要的次生代謝產(chǎn)物生物堿、糖苷、皂苷、碳水化合物、單寧、酚類化合物、蛋白質和脂肪。Baskar Kathirvelu等[8]得出黃果茄對棉鈴蟲具有毒性作用。Parmar Komal M等[9]研究表明黃果茄對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合具有很好的效果。

本試驗采用超聲波輔助提取黃果茄中總黃酮，通過Al（NO3）3-NaNO2顯色法測定黃果茄總黃酮含量，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化黃果茄總黃酮提取工藝，通過顯色反應可以對黃酮類化合物的種類及結構進行初步推測，通過測定總黃酮對DPPH·和·OH的清除率以及總抗氧化能力的方法評價其體外抗氧化活性，為黃果茄的藥用開發(fā)提供試驗研究基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

黃果茄：采于云南省紅河州個舊市卡房鎮(zhèn)村邊、路旁，晾曬至干，將曬干的黃果茄置于溫度為60℃的鼓風干燥箱中烘干，冷卻至30℃，粉碎，過篩，將其裝入密封袋低溫避光保存。

1.2 試劑

無水乙醇、氫氧化鈉、抗壞血酸、亞硝酸鈉、水楊酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；硝酸鋁（分析純）：北京康普匯維科技有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；過氧化氫（分析純）：重慶創(chuàng)導化工有限公司；三氯化鐵（分析純）：上海展云化工有限公司；鉬酸銨（分析純）：天津市化學試劑四廠；DPPH、蘆?。藴势罚篈cros公司。

1.3 儀器和設備

UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；WJX-100高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿(mào)有限公司；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：河南省豫華儀器有限公司；DHG-9245A鼓風干燥箱：江蘇同君儀器科技有限公司；FA3204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；DLAB移液器：大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

2 方法

2.1 提取工藝研究

2.1.1 試驗設計

2.1.1.1 單因素試驗設計

以黃果茄總黃酮提取率為考察指標，分別探討提取時間[10、20、30、40、50、60 min，固定料液比 1 ∶50（g/mL）、溫度 30℃、乙醇體積分數(shù)30%]、料液比[1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），固定提取時間30min、溫度30℃、乙醇體積分數(shù)30%]、溫度[30、40、50、60、70、80 ℃，固定提取時間 30 min、料液比 1∶60（g/mL）、乙醇體積分數(shù) 30%]、乙醇體積分數(shù)[30%、40%、50%、60%、70%、80%，固定提取時間30 min、料液比 1 ∶60（g/mL）、溫度 50℃]對黃果茄總黃酮提取率的影響。在相同條件下結果平行測定3次，取平均值。

2.1.1.2 正交試驗優(yōu)化及黃果茄總黃酮含量的測定

根據(jù)單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化黃果茄總黃酮的最佳提取工藝，所有試驗平行測定3次[10]。正交優(yōu)化分析出黃果茄總黃酮的最佳提取工藝，并在最佳工藝條件下測定黃果茄中總黃酮含量，驗證優(yōu)化試驗的合理性。

2.1.2 試驗方法

2.1.2.1 測定方法原理

黃酮化合物與亞硝酸鈉發(fā)生氧化還原反應，然后與鋁離子結合形成穩(wěn)定的化合物，氫氧化鈉可使其顯色，在可見光區(qū)處有特征吸收峰，其吸光度值與總黃酮質量濃度呈線性關系[11]。

2.1.2.2 黃果茄供試品溶液的制備

稱取1.0 g黃果茄粉末于不同試驗條件下通過超聲波輔助對黃果茄總黃酮進行提取，趁熱抽濾，定容，得供試品溶液。

2.1.2.3 黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定

參考文獻[12]采用氫氧化鈉法、濃氨水法、三氯化鐵法和鹽酸-鎂粉法，通過觀察其顏色變化推測黃果茄提取液中黃酮類化合物的種類和結構。

2.1.2.4 檢測波長的選擇與標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁標準品20.00 mg，加入80%乙醇溶解，定容至100 mL，得0.20 mg/mL蘆丁標準溶液。

采用Al（NO3）3-NaNO2顯色法[13]，配制標準系列溶液，以不加蘆丁標液的溶液為參比，在300 nm～700 nm范圍內(nèi)掃描，檢測最大吸收峰，確定出最佳檢測波長。并在最佳檢測波長條件下檢測系列標準溶液的吸光度A。以蘆丁質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，通過軟件Origin 9.0得到線性回歸方程。

2.1.2.5 黃果茄總黃酮含量測定方法

準確移取供試品樣液1.00 mL于10 mL容量瓶中，按2.1.2.4的方法加入相同劑量相同種類的試劑，測定其吸光度，利用線性回歸方程計算出供試品溶液中總黃酮的質量濃度，然后按下列公式計算出黃果茄總黃酮提取率。總黃酮提取率計算公式為：

式中：C為供試品樣液的質量濃度，μg/mL；V為供試品樣液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為黃果茄粉末質量，g。

2.2 黃果茄總黃酮體外抗氧化活性研究

2.2.1 ·OH清除率的測定

根據(jù)寇亮等[14]的測定方法，稍作改動。取5個10 mL的容量瓶并編號，準確移取質量濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的黃果茄樣品溶液各1.00 mL于相應編號的容量瓶中，按順序加入1.00mL5mmol/mL H2O2溶液、2.00 mL 5 mmol/mL FeSO4溶液和5.00 mL 5 mmol/mL水楊酸乙醇溶液，蒸餾水定容至刻度線，搖勻，將容量瓶置于溫度為37℃的恒溫水浴鍋中反應30 min，于510 nm處測定其吸光度值Ax。另取5個10 mL的容量瓶并編號，以不加入H2O2溶液作為試驗對照組，其余按照上述步驟操作，測定其吸光度值Ax0。再取一個10 mL的容量瓶，以不加黃果茄總黃酮樣品溶液作為空白對照，其余操作同上，測定其吸光度值A0。同時，以相同質量濃度的VC溶液作為陽性對照。按以下公式計算黃果茄總黃酮對·OH的清除率：

式中：Ax是樣品組吸光度值；Ax0是試驗對照組吸光度值；A0是空白組溶液的吸光度值。

2.2.2 DPPH·的清除率的測定

參照王曉林等[15]的測定方法，稍作改動。用電子天平精確稱取10.0 mg DPPH于燒杯中，用無水乙醇溶解后轉移至100 mL容量瓶中，定容，充分搖勻，得到質量濃度為0.10 mg/mL的DPPH標準溶液，并將其置于暗處備用。取5個10 mL的容量瓶并編號，準確移取質量濃度 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的黃果茄樣品溶液各2.00 mL于相應編號的容量瓶中，加入2.00 mL的DPPH標準溶液，用無水乙醇定容，避光放置30 min后，于517 nm波長下測定吸光度值Ax。另外取5個10 mL的容量瓶并編號，用無水乙醇代替DPPH標準溶液作為對照組，其余按照上述步驟操作，測定其吸光度值Ax0。再另取一個10 mL容量瓶，不加黃果茄樣品溶液，其余操作同上，測定其吸光度值A0。同時，以相同質量濃度的VC溶液作為陽性對照。按以下公式計算黃果茄總黃酮對DPPH·的清除率：

式中：Ax為樣品組吸光度值；Ax0為試驗對照組吸光度值；A0為空白組溶液的吸光度值。

2.2.3 總抗氧化能力測定

參照曹旭等[16-17]的測定方法，稍作改動。取5個10 mL的容量瓶并編號，準確移取質量濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的黃果茄樣品溶液各2.00 mL于相應編號的容量瓶中，依次加入2.50 mL 0.6 mol/mL硫酸、2.50 mL 28 mmol/mL磷酸氫二鈉溶液和2.50 mL 4 mmol/mL的鉬酸銨溶液，搖勻，將其置于溫度為95℃的恒溫水浴鍋中反應90 min，于695 nm處測定其吸光度值A。另外取一個10 mL的容量瓶，以2.00 mL無水乙醇溶劑代替樣品液作為參比溶液。同時，以相同質量濃度的VC溶液作為陽性對照，與黃果茄總黃酮的總抗氧化能力進行比較。吸光度值越大表示黃果茄總黃酮的還原能力越強，即抗氧化能力越強，因此，吸光度值可作為評價總抗氧化能力大小的指標。

2.3 數(shù)據(jù)分析

全文涉及的試驗數(shù)據(jù)結果處理采用Origin9.0軟件統(tǒng)計計算并作圖，工藝優(yōu)化采用L9（34）正交優(yōu)化分析方法。

3 結果與分析

3.1 檢測波長的確定

檢測波長的測定結果見圖1。

圖1 檢測波長的確定Fig.1 Determination of detection wavelength

由圖1可知，測定溶液在501 nm處出現(xiàn)峰值，因此確定黃酮類化合物的檢測波長為501 nm。

3.2 蘆丁標準曲線的確定

蘆丁標準曲線的測定結果見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

由圖2可知，標準曲線的線性回歸方程為y=0.010 8x+0.001 5，R2=0.999 7。測定范圍內(nèi)，線性較好，在此區(qū)間內(nèi)蘆丁質量濃度與吸光度呈線性增長。

3.3 黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定結果

黃果茄提取液中黃酮類化合物的鑒定結果見表1。

表1 黃酮類化合物的顏色反應Table 1 Color reaction results of the flavonoids compound

由此可以初步推斷，黃果茄提取液中總黃酮主要為黃酮類、二氫黃酮類、查爾酮類和異黃酮類，且化合物中可能含有游離的酚羥基。由于表1所列的反應顏色，只是某類黃酮體中大多數(shù)化合物所具有的共同顏色，要明確黃果茄提取液中的具體黃酮成分仍需做進一步的鑒定[18]。

3.4 單因素的試驗結果

3.4.1 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，隨著提取時間的增加，黃果茄總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，最佳提取時間為30 min，之后總黃酮提取率逐漸下降。其原因可能是：隨著提取時間的增加，黃果茄中的總黃酮不斷溶于乙醇溶液中，提取率不斷升高，當總黃酮全部溶出后，較長的提取時間可能導致黃酮類物質發(fā)生降解，提取率下降[19]。因此選取提取時間30 min為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.2 料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響結果見圖4。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，隨著溶劑體積不斷增大，黃果茄總黃酮提取率不斷增大，最佳料液比為1∶60（g/mL），之后提取率趨于平緩。因此選取料液比1∶60（g/mL）為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.3 溫度對總黃酮提取率的影響

溫度對總黃酮提取率的影響結果見圖5。

圖5 溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，黃果茄總黃酮提取率隨溫度升高先增大后減少，超聲溫度50℃為最佳，之后總黃酮提取率顯著下降。其原因可能是：溫度越高分子運動的速率越快，從而使黃酮類物質更易溶于溶劑中，可是溫度過高會破壞黃酮類化合物的結構及生物活性，還會增加其它雜質的析出，導致提取率急劇下降[20]。因此，選取提取溫度50℃為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.4.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響結果見圖6。

圖6 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction rate

由圖6可知，乙醇體積分數(shù)不斷增大，黃果茄總黃酮提取率先增大后減小，乙醇體積分數(shù)50%時總黃酮提取率最佳，之后總黃酮提取率顯著下降。其原因可能是：乙醇溶液有利于黃酮類化合物溶出，增大乙醇體積分數(shù)，黃果茄中的黃酮類物質更容易溶出。但是，過大的乙醇體積分數(shù)會使大分子物質發(fā)生凝聚而使溶液變得濃稠，降低總黃酮的溶出率。因此，選取乙醇體積分數(shù)50%為正交優(yōu)化依據(jù)。

3.5 正交試驗結果

L9（34）正交試驗因素水平表見表2。試驗設計及黃果茄總黃酮提取率的結果見表3。

表2 正交試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal design

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experimental

通過極差分析可以看出，各因素對黃果茄總黃酮提取率的影響程度為A>B>C>D，即時間是影響黃果茄總黃酮提取率的主要因素，其次是料液比、溫度、乙醇體積分數(shù)。其最佳提取工藝條件為A3B3C2D2，即提取時間 40 min，料液比 1 ∶70（g/mL），溫度50℃，乙醇體積分數(shù)50%。在此最佳提取工藝條件重復試驗3次，測得黃果茄總黃酮提取率為4.35%。其中A3B3C2D1為9組中的實際最優(yōu)組合，在該工藝條件下再次重復試驗3次，測得黃果茄總黃酮提取率為4.28%。因此，確定黃果茄總黃酮的最佳提取工藝條件組合為A3B3C2D2。

3.6 黃果茄總黃酮體外抗氧化活性研究

3.6.1 黃果茄總黃酮對·OH的清除效果

黃果茄總黃酮對·OH的清除效果見圖7。

圖7 總黃酮和VC對·OH的清除作用Fig.7 Hydroxyl radical scavenging effects of total flavonoids and VC

由圖7可知，隨著黃果茄總黃酮質量濃度的增加，對·OH清除能力逐漸增強，質量濃度超過100 μg/mL后，清除率增加趨勢緩慢。在質量濃度為50 μg/mL～130 μg/mL的范圍內(nèi)時，相同質量濃度的VC溶液的清除能力小于黃果茄總黃酮提取液，當質量濃度超過130 μg/mL時，VC對·OH的清除能力強于黃果茄總黃酮提取液。

3.6.2 黃果茄總黃酮對DPPH·的清除效果

黃果茄總黃酮對DPPH·的清除效果見圖8。

圖8 總黃酮和VC對DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH radical scavenging effects of total flavonoids and VC

由圖8可知，隨著黃果茄總黃酮質量濃度的不斷增加，對DPPH·清除能力逐漸增強，當質量濃度大于150 μg/mL時，清除率不再有明顯的增大。VC對DPPH自由基有著較強的清除能力，相同質量濃度下，VC的清除能力始終強于黃果茄總黃酮，且VC溶液質量濃度為50 μg/mL時，清除率就已經(jīng)達到90%以上，之后雖然質量濃度不斷增加，但清除率不再較大幅度地增加。

3.6.3 黃果茄總黃酮的總抗氧化能力測定結果

黃果茄總黃酮的總抗氧化能力測定結果見圖9。

圖9 總黃酮和VC的總抗氧化能力的測定Fig.9 Determination of total antioxidant activity of total flavonoids and VC

由圖9可知，VC和黃果茄總黃酮的總抗氧化能力隨質量濃度的增加而不斷增強，兩者之間呈線性關系。當質量濃度為50 μg/mL時，黃果茄總黃酮與VC的總抗氧化能力相當，而質量濃度超過50 μg/mL后，VC的總抗氧化能力明顯強于黃果茄總黃酮。

4 結論

本試驗選擇超聲波輔助提取方法，乙醇為提取溶劑，對黃果茄總黃酮的提取工藝、種類及結構的鑒定及體外抗氧化活性進行相關研究。通過一系列顯色反應，初步推斷黃果茄提取液中黃酮類化合物主要為黃酮類、二氫黃酮類、查爾酮類和異黃酮類。探討了提取時間、料液比、溫度及乙醇體積分數(shù)對黃果茄總黃酮提取率的影響，在單因素試驗基礎上設計正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，得到提取時間40 min，料液比1∶70（g/mL），溫度50℃，乙醇體積分數(shù)50%為黃果茄總黃酮的最佳提取工藝條件。在此條件下，黃果茄總黃酮提取率可達4.35%。最后，通過探究黃果茄總黃酮對·OH、DPPH·的清除率及總抗氧化能力，說明在受測范圍內(nèi)，黃果茄總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。目前，對黃果茄的化學成分研究報道甚少，物質基礎不明確，難以確定黃果茄中主要的活性成分。本次研究優(yōu)化了黃果茄總黃酮的提取工藝，初步推斷黃酮類化合物的類型，并探究其體外抗氧化活性，對后續(xù)黃果茄的化學成分提取分離和抗病機制研究具有一定的參考價值。