夏名軒 金杰人 肖明

摘 ?要：?從細(xì)菌生物膜與真菌、其他細(xì)菌、原生動物及噬菌體4個角度對其作用進(jìn)行了綜述。在細(xì)菌與真菌之間，生物膜不僅是細(xì)菌的拮抗手段，也可介導(dǎo)兩者之間的共存。在應(yīng)對異種細(xì)菌時，其作為一種物理防御手段與入侵者競爭。遭受原生動物捕食時，生物膜的致密程度上升以應(yīng)對原生動物的沖擊，或是減少生物膜形成，形成不易被掠食的微菌落。而在抵抗噬菌體侵染方面，生物膜的作用包括使菌體緊密排列，調(diào)節(jié)本身化學(xué)成分變化及群體感應(yīng)功能，抑制噬菌體感染。

關(guān)鍵詞：?細(xì)菌;?生物膜;?真菌;?原生動物;?噬菌體

中圖分類號： Q 939.9 ???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：?A ???文章編號：?1000-5137（2020）05-0589-07

Study on the relationship between bacterial biofilm and various microbial taxa

XIA Mingxuan， JIN Jieren， XIAO Ming^*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract：?This paper reviews the effects on bacterial biofilms from perspectives of fungi，other bacteria，protozoa and bacteriophages.Between bacteria and fungi，the biofilms are not only means of antagonism of bacteria，but also intermediate coexistence of the two.When dealing with heterogeneous bacteria，it competes with intruders as a physical defender.When it suffers from predators predation the density of biofilms increased to cope with the impact of protozoa，or the formation of biofilms reduced and then the uneasily predated microcolonies formed.In terms of resistance to bacteriophages infection，the role of biofilms includes aligning the bacteria closer，regulating their chemical composition and their quorum sensing，to inhibit bacteriophage infection.

Key words：?bacteria;?biofilm;?fungus;?protozoan;?bacteriophage

0 ?引 ?言

自然環(huán)境之中的細(xì)菌通常生活在結(jié)構(gòu)復(fù)雜并處于動態(tài)變化的生物系統(tǒng)中，即生物膜（ biofilm）。生物膜通常指附著于有生命或無生命基質(zhì)表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有一定組織的細(xì)菌群體，并擁有自身獨(dú)特的生命周期（圖1）^[1]。這些細(xì)菌胞外大分子的種類會隨菌種的變化而異，但一般由蛋白質(zhì)、胞外多糖、胞外DNA、肽聚糖和磷脂等物質(zhì)組成^[2]。這些胞外大分子的組合統(tǒng)稱為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix），所有細(xì)菌生物膜的共同特征是存在細(xì)胞外基質(zhì)，其將細(xì)胞聚集在一起，為生物膜結(jié)構(gòu)提供穩(wěn)定性，還可以增強(qiáng)細(xì)胞對干旱、滲透壓等環(huán)境壓力的抵抗力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝交換，使細(xì)胞更有效定殖于載體表面，并增加水平基因轉(zhuǎn)移的幾率^[3]。

細(xì)菌生物膜對社會生產(chǎn)的影響已經(jīng)眾所周知。在農(nóng)業(yè)上，使用具有生物膜發(fā)育等多種促進(jìn)植物生長特性的植物根際促生菌以減輕農(nóng)作物所受到的環(huán)境脅迫并提高產(chǎn)量^[4]。在工業(yè)上，某些海洋微生物會在船舶、線纜等物體表面形成致密的生物膜，對海洋環(huán)境中服務(wù)的基礎(chǔ)設(shè)施和設(shè)備產(chǎn)生嚴(yán)重的材料腐蝕^[5]。在醫(yī)療衛(wèi)生上，細(xì)菌生物膜的形成不僅與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)，近期有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜甚至可能與某些癌癥的形成存在關(guān)聯(lián)^[6]。

但是以往的研究較少關(guān)注細(xì)菌生物膜在各微生物類群之間的作用，包括真菌、原生動物甚至是不同種的細(xì)菌。不同微生物類群之間通過不斷相互作用構(gòu)成所謂的微生物群落。因此可以說在生物膜中生長的微生物細(xì)胞彼此之間，以及與它們所處的環(huán)境和生活在同一生態(tài)位的其他微生物之間，都處于連續(xù)不斷的相互接觸中。因此，本文作者將重點(diǎn)討論細(xì)菌生物膜在各微生物類群之間所扮演的角色與作用。

1 ?細(xì)菌與真菌

土壤中的細(xì)菌與真菌之間發(fā)生著包括共生、拮抗在內(nèi)的各種相互作用。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種植物根際微生物，常被用作生物農(nóng)藥以及生物膜形成的模型^[7]?？莶菅挎邨U菌ALBA01與土壤真菌Setophoma terrestris相互作用、共同培養(yǎng)后，與單獨(dú)培養(yǎng)的相比，具有更強(qiáng)的生物膜形成能力。在此過程中，與表面活性素（surfactin，一種細(xì)胞外基質(zhì)成分）合成相關(guān)的srfAA基因起著至關(guān)重要的作用，該基因的缺失會顯著破壞枯草芽孢桿菌ALBA01的抗真菌能力^[8]。

隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生物膜在細(xì)菌與真菌之間的作用比以往認(rèn)為的更加復(fù)雜。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見的植物病原菌，當(dāng)枯草芽孢桿菌在黑曲霉存在條件下生長時，也可以通過形成類似于生物膜的結(jié)構(gòu)附著和生長在黑曲霉的菌絲上，與真菌發(fā)生類似的相互作用。但BENOIT等^[9]根據(jù)雙轉(zhuǎn)錄組實驗獲得的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和黑曲霉在這種相互作用過程中改變了正常代謝。當(dāng)枯草芽孢桿菌的生物膜附著于黑曲霉菌絲上時，與枯草芽孢桿菌的抗真菌以及相關(guān)的抗菌防御機(jī)制基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)了一定水平的降低。同時還發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與黑曲霉共培養(yǎng)時，其表面活性素的產(chǎn)量下降。這意味著細(xì)菌和真菌之間不僅存在著諸如直接競爭和間接競爭、對抗和營養(yǎng)消耗等對相互作用的種群成員具有負(fù)面影響的作用，而且它們在相互拮抗的過程中改變了原先的生長特性，在某些情況下甚至適應(yīng)或支持彼此，同時提高了群落的適應(yīng)性。

2 ?細(xì)菌與細(xì)菌

以往的研究報道了在芽孢桿菌和其他細(xì)菌交互作用中，生物膜中，細(xì)胞外基質(zhì)成分表達(dá)的差異轉(zhuǎn)錄控制^[10]，但這些發(fā)現(xiàn)僅僅支持了生物膜對芽孢桿菌適應(yīng)其他種類細(xì)菌存在的假設(shè)，少有研究直接證明這種細(xì)菌結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)細(xì)菌與細(xì)菌相互作用方面的功能意義。

CARLOS等^[11]探討了枯草芽孢桿菌3610生物膜的細(xì)胞外基質(zhì)在預(yù)防綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）PCL1606菌落入侵的功能作用?？莶菅挎邨U菌的細(xì)胞外基質(zhì)主要由胞外多糖（epsA-O操縱子編碼基因合成的組成）、TasA（由三基因操縱子yqxM/tapA-sipW-tasA中編碼的一種功能性淀粉樣蛋白）以及BslA（參與生物膜上疏水外膜的形成）組成^[12]?？莶菅挎邨U菌eps，tasA，bslA三基因突變體（稱為Δmatrix）菌落與綠針假單胞菌菌落發(fā)生相互作用96 h后，綠針假單胞菌菌落能夠滲透，并完全定殖于枯草芽孢桿菌菌落中，而這兩種細(xì)菌的野生型菌落之間仍然保持著明顯的界線。這些發(fā)現(xiàn)顯示細(xì)胞外基質(zhì)具有物理防御作用，而eps和bslA基因?qū)@種相互作用尤為重要。利用磁共振成像和固態(tài)核磁共振的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的缺失導(dǎo)致細(xì)胞集落更小、流動性更強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)的缺乏會引起芽孢桿菌菌落生物物理特性的變化，從而破壞其完整性和對入侵的抵抗力，這種變化可能有利于綠針假單胞菌的滲透。

細(xì)菌的相互作用是由不同因素的組合來定義的，例如不同代謝途徑的激活以及信號化合物、抗生素和群體感應(yīng)分子的產(chǎn)生和分泌^[13]。這些化合物可以通過細(xì)菌分泌系統(tǒng)、外排泵、轉(zhuǎn)運(yùn)體和膜泡排泄到細(xì)胞外空間。分泌機(jī)制可以是化合物特異性的，也可以是能夠分泌廣譜化合物的，有些機(jī)制需要相互作用的細(xì)胞之間緊密的物理連接，比如T6SS（type VI secretion system），這是一種能夠?qū)⒎肿又苯虞斔偷狡渌?xì)胞的管狀穿刺裝置。假單胞菌屬的細(xì)菌可以利用它們的T6SS操縱和破壞真核宿主細(xì)胞^[14]。這是已知的細(xì)菌和真核細(xì)胞相互作用和發(fā)病機(jī)理的一個重要的機(jī)制，但該系統(tǒng)對革蘭氏陽性細(xì)菌的作用還尚不明確。CARLOS等^[11]研究了T6SS在綠針假單胞菌和枯草芽孢桿菌兩者菌落的交互作用，發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌Δmatrix突變體產(chǎn)生交互作用相比，與野生型的枯草芽孢桿菌作用時假單胞菌的T6SS啟動子表達(dá)明顯升高，表明綠針假單胞菌利用T6SS作為一種強(qiáng)大的攻擊策略來與競爭對手競爭，而枯草芽孢桿菌通過擁有完整細(xì)胞外基質(zhì)的生物膜以及產(chǎn)生芽孢來對這種行為作出反擊。除此之外，表面活性素也在這種菌落之間的相互作用中扮演著重要的角色。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為芽孢桿菌所產(chǎn)生的表面活性素對其他細(xì)菌具有抑制作用^[15]，但實際上，當(dāng)綠針假單胞菌與無表面活性素產(chǎn)生的ΔmatrixΔsurf菌株交互作用時，與產(chǎn)表面活性素Δmatrix相比，綠針假單胞菌對芽孢桿菌菌落的入侵程度減少了，表面活性素似乎間接促進(jìn)了PCL1606菌落的傳播。綠針假單胞菌可能劫持枯草芽孢桿菌的表面活性素來加速其運(yùn)動性，并進(jìn)一步滲透無完整細(xì)胞外基質(zhì)的芽孢桿菌菌落。

3 ?細(xì)菌與原生動物

早期關(guān)于原生動物與細(xì)菌生物膜的研究集中于廢水處理的活性污泥法，SYLVAINE等^[16]發(fā)現(xiàn)原生動物對細(xì)菌的掠食行為可能是污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌清除的重要生物學(xué)機(jī)制。KRZYSZTOF等^[17]利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）和數(shù)字圖像分析技術(shù)，研究了原生動物對細(xì)菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)活性污泥中的細(xì)菌生物膜生活在以鞭毛蟲（Bodo saltans）為主的原生動物群落的掠食壓力之下，活性污泥中的原生動物最初會干擾生物膜的發(fā)育，但隨后會刺激其生長。

先前的研究表明：原生生物的掠食會改變細(xì)菌生物膜的形態(tài)，并可能導(dǎo)致諸如微菌落等抗捕食特征的形成^[18]。比如細(xì)菌Serratia marcescens通過形成小菌落和絲狀結(jié)構(gòu)，對鞭毛蟲以及阿米巴變形蟲的捕食具有抗性^[19]。DOPHEIDE等^[20]利用兩種纖毛蟲（Tetrahymena sp.，Chilodonella sp.）研究原生動物對兩種細(xì)菌（Pseudomonas costantinii，Serratia plymuthica）生物膜的取食作用（圖2），通過活體共聚焦掃描顯微鏡揭示了不同的細(xì)菌生物膜針對不同原生動物的捕食表現(xiàn)出的防御策略。S.plymuthica的生物膜細(xì)胞在Tetrahymena sp.的捕食作用下更加緊密地聚集在一起，在整個生物膜中形成孔和通道，但沒有形成任何明顯的抵抗捕食的結(jié)構(gòu)。P.costantinii的生物膜對Tetrahymena sp.捕食的反應(yīng)與之前的研究一致，P.costantinii的生物膜減少，形成孤立的、不易被掠食的微菌落。Tetrahymena sp.對細(xì)菌生物膜的消耗被認(rèn)為是由于其強(qiáng)大的自由游動的運(yùn)動能力對細(xì)菌生物膜產(chǎn)生沖擊，導(dǎo)致附著于生物膜上的細(xì)菌細(xì)胞的脫出并進(jìn)入游離狀態(tài)，隨后將其攝入^[21]。Chilodonella sp.對S.plymuthica生物膜產(chǎn)生的影響與Tetrahymena sp.不同。Chilodonella sp.的運(yùn)動捕食行為可能造成S.plymuthica細(xì)菌生物膜中細(xì)胞的移動，促進(jìn)了游離細(xì)菌而不是生物膜細(xì)胞的生長。在Chilodonella sp.對S.plymuthica細(xì)菌生物膜發(fā)生捕食作用后，S.plymuthica的整體向著微菌落的形態(tài)發(fā)展，而對于P.costantinii而言，則導(dǎo)致了生物膜中的細(xì)胞均勻分散。

SIMONE等^[22]使用假單胞菌Pseudomonads與阿米巴變形蟲Acanthamoeba castellanii來研究它們對小麥生長和健康的影響。發(fā)現(xiàn)在沒有阿米巴變形蟲的情況下，細(xì)菌分離物幾乎對植物無有益的作用，一些分離物甚至被病原體利用來加速自身的生長。而與阿米巴變形蟲的共接種則抑制了這種關(guān)系，致使植物在存在病原體的情況下仍然能生長并減少病原菌的有害影響。一些原生動物如纖毛蟲和鞭毛蟲對大腸桿菌、軍團(tuán)菌Legionella等細(xì)菌具有強(qiáng)力的捕食作用，因此也許能利用這些生物體來作為農(nóng)作物上人類致病菌的潛在控制劑^[23-24]。由于細(xì)菌在與植物的相互作用中是以群體而不是以個體為單位的，如植物根際促生菌往往形成生物膜結(jié)構(gòu)，覆蓋在植物根際的表面，以此發(fā)揮作用。植物根系通過產(chǎn)生根際分泌物能夠影響根際的土壤生境，根際分泌物中特定的信號分子吸引植物根際促生菌至植物根際^[25]，細(xì)菌能夠沿信號梯度定向游動至根際并定殖，即細(xì)菌趨化性（bacterial chemotaxis）^[26]，這種趨化性對細(xì)菌生物膜的形成具有一定影響，比如玉米的根系分泌物能夠刺激并促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9的tapA-sipW-tasA操縱子表達(dá)，幫助其在玉米根系定殖并形成生物膜^[27]。除此之外，根際分泌物也有可能對原生動物產(chǎn)生影響，因為原生動物通過某些化學(xué)感受器來感知細(xì)菌生物膜的某些特定化學(xué)信號分子，以此來定位細(xì)菌生物膜所在的區(qū)域^[28]，而植物根際分泌物化學(xué)成分對于這些化學(xué)感受器的影響還尚不明確。

4 ?細(xì)菌與噬菌體

細(xì)菌生物膜能夠增強(qiáng)菌體對干旱、滲透壓等非生物壓力的抵抗力，同樣，細(xì)菌生物膜也對諸如噬菌體這類生物侵染具有抗性，如甲型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi A）的生物膜形成能力與其噬菌體抗性呈正相關(guān)^[29]。雖然某些能夠誘導(dǎo)解聚酶產(chǎn)生的噬菌體可以通過降解生物膜外聚基質(zhì)的成分穿透生物膜的內(nèi)層，但由于噬菌體的識別受體幾乎全部位于對應(yīng)細(xì)菌的外部結(jié)構(gòu)上，生物膜中菌體的緊密排列會遮蔽部分噬菌體受體，導(dǎo)致噬菌體侵染效率的下降^[30]。此外，某些細(xì)菌能夠通過改變生物膜的化學(xué)成分以阻止噬菌體的吸附，如流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza）能夠修正lic2A基因并對其重復(fù)編碼，從而在胞外基質(zhì)中合成低脂聚糖聚合物，阻礙噬菌體HP1c1的感染^[31]。由于細(xì)菌生物膜本質(zhì)上是細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing）的產(chǎn)物，因此在噬菌體與細(xì)菌生物膜的交互過程中，細(xì)菌群體感應(yīng)的概念被引入其中。在T4噬菌體侵染大腸桿菌的過程中，大腸桿菌群體感應(yīng)基因ydiV調(diào)節(jié)菌體脂多糖（LPS）的合成，改變生物膜狀態(tài)，通過物理阻隔影響噬菌體的吸附和感染，這首次描述了群體感應(yīng)系統(tǒng)在噬菌體感染細(xì)菌生物膜過程中的功能與作用^[32] 。

5 ?討 ?論

了解共享生態(tài)位的微生物物種之間相互作用的行為和機(jī)制是研究微生物種群進(jìn)化的基礎(chǔ)^[33]。而在它們的交互作用中，重要的是要理解不同的微生物在生存適應(yīng)性中使用的潛在策略，以及這些策略如何有益于自身^[34]。

本文作者探討了細(xì)菌生物膜在細(xì)菌與其他各微生物類群之間所扮演的角色。在細(xì)菌與真菌之間，人們先前認(rèn)為生物膜僅作為一種細(xì)菌的拮抗手段來應(yīng)對真菌的入侵，但更為深入的研究表明其可能作為一種媒介介導(dǎo)兩者之間的共存。在應(yīng)對異種細(xì)菌時，生物膜往往作為一種物理防御手段與入侵者競爭，某些細(xì)菌的生物膜甚至演化出如T6SS的攻擊策略來殺傷對手。遭受原生動物捕食時，不同種細(xì)菌的生物膜變化不盡相同，或是增加生物膜的致密程度以應(yīng)對原生動物的沖擊，或是減少生物膜形成，形成不易被掠食的微菌落。而在抵抗噬菌體侵染方面，生物膜的作用更為多樣，包括使菌體緊密排列遮蔽部分噬菌體受體，導(dǎo)致噬菌體侵染效率下降;調(diào)節(jié)本身化學(xué)成分變化，影響噬菌體的吸附;通過群體感應(yīng)功能改變生物膜狀態(tài);通過物理阻隔抑制噬菌體感染。

由于相關(guān)的文獻(xiàn)與資料比較缺乏，目前關(guān)于細(xì)菌生物膜的研究主要集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，比如說生物分子對于細(xì)菌生物膜的形成作用^[35]以及細(xì)菌生物膜產(chǎn)生的耐藥性^[36]等方面，關(guān)于此方面的論述不夠詳細(xì)。值得注意的是，現(xiàn)在關(guān)于細(xì)菌與植物關(guān)系的研究中往往把細(xì)菌以個體為單位進(jìn)行闡述，而事實上，不能忽略細(xì)菌整體，即生物膜對于植物的作用。FIROZ等^[4]利用具有生物膜形成能力的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）FAB10菌株緩解鹽分對小麥的脅迫并促進(jìn)其生長，這有力證明了細(xì)菌生物膜對植物的正向作用。當(dāng)然，由于微生物-土壤-植物體系的復(fù)雜性，在實際環(huán)境中研究細(xì)菌生物膜的作用是非常困難的，不僅是在土壤中難以觀測到生物膜的具體形態(tài)，土壤-植物根系體系還處于動態(tài)變化中，這使研究更為困難。

以往關(guān)于細(xì)菌生物膜的研究往往是在離體條件下，利用延時共聚焦顯微鏡（Time-lapse confocal microscopy）進(jìn)行觀察，但離體條件存在一定的局限性，無法真實反映細(xì)菌生物膜的狀況。現(xiàn)在，通過將特定的熒光基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞，如熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，再利用共聚焦激光掃描顯微鏡來對其進(jìn)行觀察，對在生物體中細(xì)菌生物膜的形成與發(fā)展的認(rèn)識更為直觀^[15，37]。此外，在自然條件下，細(xì)菌生物膜往往包含若干種細(xì)菌，但當(dāng)前對于細(xì)菌生物膜的研究局限于單一菌種的生物膜，不同微生物共同形成的細(xì)菌生物膜少有文獻(xiàn)論述^[38]，這是目前研究的短板，希望日后的研究更加重視。

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（責(zé)任編輯：顧浩然）