倪瀚文，吳立群

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心臟內(nèi)科，上海 200025）

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種亞群，其包含了大量的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，如信號在不同細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)能維持組織內(nèi)環(huán)境恒定以及作出應(yīng)激反應(yīng)。心血管系統(tǒng)作為一個復(fù)雜的、由多種細(xì)胞組成的系統(tǒng)，外泌體在心肌細(xì)胞間充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。前期外泌體相關(guān)研究較多集中于腫瘤的發(fā)病機制、診斷及治療，而近年外泌體在心血管系統(tǒng)中的作用越來越受到重視。目前，關(guān)于外泌體在心血管疾病中的研究已獲得了較多進(jìn)展，尤其在診斷和治療方面進(jìn)展突出，提示外泌體可能是今后治療心血管疾病的潛在方向。心肌缺血及心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床常見的心血管疾病，近年關(guān)于外泌體在其診治中的應(yīng)用研究進(jìn)展較快，本文將就當(dāng)前的相關(guān)研究熱點作一綜述。

外泌體的組成及生理作用

一、外泌體的成分及來源

外泌體作為細(xì)胞外囊泡的一種，其直徑為30～150 nm，可由不同類型的細(xì)胞釋放[1]。外泌體可以在血漿、血清、唾液、羊水、母乳和尿液等多種體液中存在，而其在體外細(xì)胞培養(yǎng)液中也同樣存在。外泌體富含各種生物活性物質(zhì)，包括DNA、mRNA、微小RNA（microRNA,miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和蛋白質(zhì)，當(dāng)這些生物活性物質(zhì)隨外泌體一起被轉(zhuǎn)運的時候，外泌體及其包裹的活性物質(zhì)成為了細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。

外泌體來自于內(nèi)涵體內(nèi)吞形成的多囊泡體，隨后多囊泡體與細(xì)胞膜融合后被分泌至細(xì)胞外[2]。外泌體內(nèi)的組成成分依賴于所來源的細(xì)胞類型，同時這些成分也很在大程度上反映了來源細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，提示外泌體的分泌、包含物及功能與其來源的細(xì)胞微環(huán)境改變密切相關(guān)。目前，尚不清楚外泌體是如何選擇其包含物組成成分的，但這些組成成分相對固定，即使被分泌到細(xì)胞外，也不會降解。

二、外泌體的生理作用

外泌體除了進(jìn)入鄰近的靶細(xì)胞外，還可以隨著體液進(jìn)入較遠(yuǎn)區(qū)域的靶細(xì)胞；外泌體依據(jù)自身的細(xì)胞來源、靶細(xì)胞特點、環(huán)境特點，可通過內(nèi)吞、膜的融合、配體受體結(jié)合等方式，識別靶細(xì)胞并進(jìn)入靶細(xì)胞[3-4]。因此，外泌體可作為一個在不同生理、病理機制下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物、診斷標(biāo)志物以及潛在的治療靶點，已成為一個新的研究方向。

心血管系統(tǒng)作為一個多種細(xì)胞組成的組織，外泌體可以在不同的細(xì)胞間進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以維持正常心血管生理狀態(tài)的穩(wěn)定，但外泌體同時也在一系列的心血管生理、病理過程中起著重要作用[4]。研究提示，外泌體不僅參與多種心血管生理、病理過程，且比細(xì)胞具有更顯著的穩(wěn)定性、生物相容性和非免疫原性。外泌體具有在低溫保存過程中不容易降解等特點，使其成為一個比全細(xì)胞治療更有效的、全新的診斷和治療方向[5]。

外泌體在心血管疾病狀態(tài)下的變化及其在診斷中的應(yīng)用

心臟各細(xì)胞釋放外泌體至體液中，因此外泌體具備了作為心臟疾病生物學(xué)標(biāo)志物的可能性。心血管疾病患者外周血循環(huán)中的外泌體有2 種來源，其一是來自于心臟各細(xì)胞，另外是來自于疾病情況下全身各細(xì)胞釋放的外泌體。目前，這2 種外泌體在外周血中尚不能被區(qū)分，但在不同的心血管疾病狀態(tài)下，其表達(dá)的數(shù)量和所包含的成分都會不同，可作為疾病變化的標(biāo)志物進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病狀態(tài)下，尤其是應(yīng)激情況下，如在衰老和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，外周血外泌體的數(shù)量會增加，但目前其機制尚未明確[6]。

來自不同心臟細(xì)胞的外泌體，其包含物的作用主要是參與調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞的功能。心臟大部分由心肌細(xì)胞組成，其他的非心肌細(xì)胞包括心肌成纖維細(xì)胞、連接心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的心肌內(nèi)皮細(xì)胞，其中內(nèi)皮細(xì)胞在維持心臟內(nèi)環(huán)境恒定中起重要作用。外泌體作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)在心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞之間進(jìn)行信息傳遞。

一、來自心肌細(xì)胞的外泌體

1.蛋白質(zhì)組學(xué)：在動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞能夠釋放外泌體，且在缺氧刺激后，外泌體釋放增加，其標(biāo)志性包含物熱休克蛋白60（heat shock protein 60,HSP60）在應(yīng)激的條件下增加。研究對缺氧刺激下由心肌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)組成成分與生理條件下相同，但其蛋白質(zhì)的量發(fā)生了改變。在這個蛋白質(zhì)組中包括了HSP60、原肌球蛋白α、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、球蛋白、肌球蛋白結(jié)合蛋白C、含纈酪肽蛋白以及HSP27、HSP90[7]。其他研究表明，缺氧刺激會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此，凋亡相關(guān)的腫瘤壞死因子α 同樣會出現(xiàn)在心肌細(xì)胞外泌體中[8]。

2.miRNA：在各種心血管疾病條件下，除外泌體中蛋白質(zhì)組學(xué)的改變外，miRNA-30a、miR-21-5p、miR-378-3p、miR-152-3p 等也有非常顯著的改變[9]。有實驗表明，心肌細(xì)胞分泌的外泌體可被心肌成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞，從而改變成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為[10]。例如，心肌細(xì)胞分泌的外泌體中的DNA 可出現(xiàn)在成纖維細(xì)胞中，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)[11]。心肌纖維化是心肌細(xì)胞受到長期損傷導(dǎo)致心臟功能受損的原因之一。動物實驗表明，心肌細(xì)胞分泌的外泌體中所包含的miR-217 被成纖維細(xì)胞所吞噬，可加速心肌纖維化[10]。

二、來自心肌成纖維細(xì)胞的外泌體

心肌成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的轉(zhuǎn)變有關(guān)，心肌成纖維細(xì)胞的分泌特性可以影響心肌其他細(xì)胞的生理活性。心肌成纖維細(xì)胞外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的動物模型研究表明，在缺氧條件下，蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量都有改變，尤其會出現(xiàn)與ECM 有關(guān)的蛋白質(zhì)改變，包括多種類型的膠原蛋白、基底膜蛋白多糖及纖維連接蛋白等；同時也伴有線粒體蛋白的改變[12]。

心肌成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中同樣包含了miRNA。大鼠實驗研究表明，心肌成纖維細(xì)胞分泌的外泌體富含rnomiR-21*，而外泌體將rno-miR-21* 轉(zhuǎn)運到心肌細(xì)胞，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[12]。研究顯示，心肌成纖維細(xì)胞分泌的外泌體是連接心肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間的重要橋梁。

三、來自內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體

心臟微血管系統(tǒng)是維持心臟健康和心臟組織恒定的重要因素，心臟內(nèi)皮細(xì)胞是血管與組織周圍之間的內(nèi)皮屏障，尤其在炎癥、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞在維持心臟組織功能恒定中起著重要作用，其不僅釋放了生長因子、細(xì)胞因子，還釋放了外泌體以介導(dǎo)細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。

四、臨床診斷應(yīng)用

1.外泌體中的miRNA： 外周血外泌體中包含的miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)等在心血管疾病的研究中都有所報道。外周血外泌體中的miRNA 是心血管疾病主要的研究對象，在不同病理狀態(tài)下，外泌體中包含物miRNA 的量會發(fā)生改變，提示其可作為診斷心血管疾病的標(biāo)志物。例如，血清外泌體hsa-miR-1、hsa-miR-133a 在急性冠脈綜合征 （acute coronary syndrome,ACS）中會升高。在急癥中，ACS 需要與急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）區(qū)別，經(jīng)典的AMI 診斷標(biāo)志物是肌鈣蛋白和肌酸激酶MB，肌鈣蛋白的峰值在心肌損傷后12 h 達(dá)到最高峰，且其水平與梗死面積成正比。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中包含的miRNA 會在AMI 患者中出現(xiàn)，而且它們要比肌鈣蛋白更早達(dá)到峰值，其中hsa-miR-192、hsa-miR-194 以及hsa-miR-34a 存在外周血的外泌體中，在AMI 伴有1 年內(nèi)心力衰竭患者的血清中升高，提示其可能是潛在的診斷標(biāo)志物[14]。在風(fēng)濕性心臟病患者外周血的外泌體中，miRNA 及l(fā)ncRNA 的表達(dá)發(fā)生變化，研究進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，其中5個相關(guān)的lncRNA 發(fā)生改變，且對應(yīng)的基因與風(fēng)濕性心臟疾病發(fā)生間有密切的關(guān)系[15]。

2.外泌體中的蛋白質(zhì)： 關(guān)于心血管疾病外周血外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的分析鮮見報道，只有Cheow 等[16]鑒定了一些新的蛋白質(zhì)可以作為心肌損傷的標(biāo)志物，這些蛋白質(zhì)分別屬于補體系統(tǒng) （C1Q1A、C5）、脂蛋白代謝 [載脂蛋白D（apolipoprotein D，ApoD）和載脂蛋白C3（apolipoprotein C3，ApoC3）]以及血小板激活途徑（血小板膜糖蛋白Ⅰb α 多肽和前血小板堿性蛋白）。

這些心血管疾病外周血外泌體的研究成果，無論是外周血外泌體數(shù)量的改變，還是外泌體包含物的改變，都是發(fā)掘潛在生物學(xué)標(biāo)志物的基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于心臟疾病的個體化診斷和預(yù)后檢測，是目前心血管疾病外泌體研究中一個比較可行的方向。

外泌體在心肌缺血及AF 診治中的應(yīng)用

外泌體作為一個治療方法已經(jīng)成為心血管疾病治療的一個方向。外泌體具有的特點包括無免疫原性、非致瘤性、比細(xì)胞更穩(wěn)定的生理活性、參與全身循環(huán)、可透過血腦屏障，更適合作為承載治療成分的載體，且其比細(xì)胞更適合凍融、易于儲存。這些特點使得外泌體成為疾病治療的一個方向[5]，無論在腫瘤治療或者心血管疾病的治療中，相關(guān)研究成果日益增多[17]。無論是在體液循環(huán)中的外泌體，還是由心臟細(xì)胞釋放的外泌體，都參與了心臟應(yīng)對應(yīng)激而產(chǎn)生的重塑過程。

從干細(xì)胞釋放的外泌體歷來被認(rèn)為在心臟疾病中具有保護(hù)心肌細(xì)胞和促進(jìn)再生的功能，因此利用干細(xì)胞體外培養(yǎng)液中收集的外泌體對心臟疾病進(jìn)行治療，已成為目前研究外泌體治療方法的主流趨勢。在研究干細(xì)胞治療心臟疾病的實驗中發(fā)現(xiàn)，外泌體具有與干細(xì)胞同樣的治療效果，由于采用干細(xì)胞治療心臟疾病具有爭議，如認(rèn)為干細(xì)胞并不附著于心肌，因此，作為心臟細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物的外泌體，在心臟修復(fù)和重塑中可能起了更重要的作用。

最新的治療研究成果顯示，在阿霉素造成的心肌損傷中會伴隨產(chǎn)生炎癥性凋亡，而用干細(xì)胞、干細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)行動物實驗治療后，干細(xì)胞和干細(xì)胞分泌的外泌體都可以提高抗炎癥因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞質(zhì)空泡化、肌原纖維丟失、細(xì)胞肥大，最終達(dá)到提高心肌功能的目的[17]。由此可見，阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌炎癥性凋亡和心臟重塑可以被干細(xì)胞及干細(xì)胞分泌的外泌體所改善。

一、心肌缺血損傷

為了避免干細(xì)胞治療相關(guān)的爭議，有研究利用在外周循環(huán)中存在的外泌體對心血管疾病進(jìn)行治療，認(rèn)為從各組織釋放的循環(huán)外泌體對心臟也有重要的作用。在ST 段抬高性AMI 中的心肌細(xì)胞缺血再灌注過程中，循環(huán)細(xì)胞、細(xì)胞因子、微小囊泡和外泌體都起著重要作用。研究結(jié)果表明，血液循環(huán)中的微小囊泡和外泌體能夠?qū)θ毖俟嘧l(fā)揮有利的影響作用，其機制為外泌體包裹了miRNA 運輸?shù)叫呐K，減少了心肌細(xì)胞缺血再灌注的損傷[18]。由此可見，外周血循環(huán)外泌體中的miRNA 不僅可以作為一個診斷標(biāo)志物，同時也可以作為一個有效的治療方法，以非心肌細(xì)胞方式保護(hù)了心臟免受損傷及參與了修復(fù)過程。

關(guān)于外泌體注射入體內(nèi)的方法，常見的是心肌內(nèi)和冠狀動脈內(nèi)注射，而經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，外泌體心肌注射比冠狀動脈內(nèi)注射更有效[19]。除了利用干細(xì)胞和外周循環(huán)產(chǎn)生的外泌體，還有實驗利用人工的方法合成外泌體進(jìn)行治療，使得其外泌體具有一定的靶向性。有研究者設(shè)計了1個肽序列CSTSMLKAC，稱為缺血心肌靶向肽，發(fā)現(xiàn)其對心臟缺血區(qū)域具有靶向性。Wang 等[20]人工設(shè)計了外泌體表面，使外泌體的內(nèi)含物可以靶向釋放到心肌組織中。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺血心肌靶向肽修飾的人工外泌體可以靶向治療心肌缺血，使心臟功能得到顯著改善。

外泌體在真正成為治療心血管疾病方法之前，從實驗室研究、動物實驗過渡到臨床應(yīng)用還有很多研究工作要做，其中標(biāo)準(zhǔn)化分離、鑒定外泌體、外泌體中的成分、外泌體的靶向性等都是目前急需解決的問題。

二、AF

AF 是臨床上最常見的慢性心律失常疾病，其發(fā)病與離子通道改變、電生理變化密切相關(guān)。鉀離子通道相關(guān)基因的突變和異位興奮灶的發(fā)生及其所導(dǎo)致的鉀通道、鈣通道異常[21]，通常被認(rèn)為是AF 發(fā)生的主要原因，同時心房基質(zhì)的改變、心房纖維化及心房擴大也與AF 的發(fā)生密切相關(guān)。盡管目前已有了多種假說，但關(guān)于AF 發(fā)生、發(fā)展的機制仍有待進(jìn)一步研究[22]。

1.預(yù)測AF 的發(fā)生：最近研究表明，外泌體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是心肌纖維化改變、心臟疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素[12]。心肌纖維化在心臟修復(fù)中起到了關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺血、缺氧情況下產(chǎn)生的外泌體促進(jìn)了心肌的纖維化，損傷的上皮細(xì)胞分泌了富含促纖維化因子外泌體，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[23]。外泌體中包含的多種miRNA 被認(rèn)為與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖、分化及纖維化形成密切相關(guān)[24]，包括miR-21、miR-425、miR-744、miR-208a 等。外泌體中包含的多種miRNA 也是心肌纖維化的標(biāo)志物。在發(fā)生心肌缺血時，這些外周血外泌體中的miRNA 會比肌鈣蛋白或者其他標(biāo)志物更早出現(xiàn)[25]。盡管目前未有直接研究表明AF 中心肌纖維化與外泌體之間的關(guān)系，但由于AF 與心肌纖維化之間密切相關(guān)，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研究AF 發(fā)生、發(fā)展的機制打下了基礎(chǔ)。

2.評估AF 嚴(yán)重程度：在AF 研究中，有研究分析了外周循環(huán)外泌體在AF 患者中的水平以及可能的來源細(xì)胞器官。研究提示，AF 患者血循環(huán)中的外泌體量顯著升高，如果伴隨著血小板的激活和內(nèi)皮的損傷，血小板來源的外泌體以及內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體量都會升高[26]。對AF 患者血清外泌體miRNA 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)5 種miRNA（miRNA-103a、miRNA-107、miRNA-320d、miRNA-486、let-7b） 在持續(xù)性AF患者中顯著升高，提示這5 種miRNA 與心房的功能、結(jié)構(gòu)、氧化應(yīng)激以及纖維化有關(guān)，是潛在的監(jiān)測AF 過程的生物學(xué)標(biāo)志物[27]。同樣，有研究比較了AF 患者與竇性心律對照者血漿外泌體中miRNA 的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿外泌體中miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p 與AF 相關(guān)，這可能是將來評估AF 嚴(yán)重程度、預(yù)后以及治療方案選擇的一個指標(biāo)[28]。

基于AF 動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在心肌凋亡、心肌纖維化生成中起重要作用，將誘導(dǎo)產(chǎn)生AF 后的動物模型心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AF 發(fā)生后的心肌細(xì)胞與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活力降低密切相關(guān)，同時miR-320d 表達(dá)水平降低；而導(dǎo)入miR-320d 后，會使心肌細(xì)胞中的miR-320d、心肌細(xì)胞分泌的外泌體升高，逆轉(zhuǎn)AF 導(dǎo)致的心肌損傷。因此，miR-320d 與AF 造成的心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活力降低密切相關(guān)，同時，其與外泌體的生成有關(guān)，miR-320d 在AF 動物模型中可誘導(dǎo)外泌體分泌的增加，這為將來嘗試采用外泌體治療AF 提供了一個新方向[29]。

外泌體中的lncRNA 也成為了AF 疾病中的研究對象。心外膜脂肪組織在AF 病理中充當(dāng)了重要角色，有研究對心外膜脂肪組織的外泌體lncRNA 進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有57個lncRNA 發(fā)生了顯著變化，這些lncRNA 與代謝過程及應(yīng)激反應(yīng)過程相關(guān)[29]。

在AF 的研究中，針對外周全血、血漿及外泌體中的線粒體DNA 進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周全血、血漿及外泌體中提取到了一定數(shù)量的線粒體DNA，但在AF 疾病組與正常組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。盡管有報道顯示，外周血中的線粒體DNA 與氧化應(yīng)激及心血管疾病有關(guān)，但目前在AF 中并沒有發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。

小結(jié)

外泌體在心血管疾病中，尤其在心肌缺血與AF 中的研究目前尚處于起步階段，盡管這是一個與心臟電生理變化密切相關(guān)的疾病，但是基于外泌體在心血管疾病研究成果的積累，在AF 研究外泌體的作用機制、診斷及治療作用也是一個值得期待的方向。