翟思月, 孔剛玉, 夏育民

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚病院，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)等離子體生物醫(yī)學(xué)中心，3.西安交通大學(xué)電氣工程學(xué)院，陜西 西安 710049)

等離子體是由部分電子被剝奪后的氣體原子或分子以及這些原子和分子被電離后產(chǎn)生的正負(fù)電子組成的離子化氣體狀物質(zhì)，是除固體、液體和氣體外，物質(zhì)存在的第四態(tài)。等離子體分為兩大類:熱平衡等離子體和非熱平衡等離子體。含有低溫度重離子的等離子體被稱為大氣壓冷等離子體(cold atmospheric plasma，CAP)[1]。CAP作為一種新興的技術(shù)，在臨床醫(yī)學(xué)中尤其是在皮膚科的應(yīng)用越來越受到大家的關(guān)注。

1 CAP的物理特征及分類

近年，熱平衡等離子體不斷發(fā)展，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大潛力。但是，患者往往無法耐受因熱平衡等離子體使得表皮溫度升高所帶來的不適；而處于非熱平衡的大氣壓冷等離子體即CAP，卻沒有這種副作用。CAP治療生物組織具有可行性，其可保證處理部位皮膚的溫度在37～38 ℃之間。這是因?yàn)樵谝粋€(gè)電場中，相比于離子，電子對(duì)于周圍環(huán)境的加熱速度更快，從而產(chǎn)生溫度為室溫或接近室溫的等離子體[2]。目前實(shí)驗(yàn)室常用的 CAP放電形式主要包括電暈放電、輝光放電、火花放電、介質(zhì)阻擋放電、滑動(dòng)弧光放電、微波等離子體及射頻等離子體等。CAP發(fā)生裝置分為三種類型：直接等離子體來源、間接等離子體來源和混合等離子體來源。直接等離子體來源是將人體(如皮膚、內(nèi)部組織等)作為電極；間接等離子體來源是指這些等離子體在兩個(gè)電極之間激發(fā)產(chǎn)生，等離子體產(chǎn)生的活性成分將作用于目標(biāo)組織；混合等離子體來源具有前述兩種等離子體發(fā)生器的優(yōu)點(diǎn)，其通過比組織電阻更小的接地金屬網(wǎng)狀電極實(shí)現(xiàn)[3],對(duì)于醫(yī)療應(yīng)用，目前主要為間接[等離子體射流(atmospheric pressure plasma jet，APPJ)]和直接[介質(zhì)阻擋放電(dielectric barrier discharges，DBD)]等離子體源。此外，等離子體可以由空氣、稀有氣體或各種混合氣體作為載體氣體，經(jīng)過多種形式激活后，放電產(chǎn)生效應(yīng)物質(zhì)[3],這些物質(zhì)包括正、負(fù)電荷離子、自由電子、中性活性氧/氮物種(ROS/RNS)，自由基和分子碎片等多種可相互轉(zhuǎn)化的粒子[4]。等離子體健康應(yīng)用是近幾年逐漸形成的思想模式，是多學(xué)科交叉研究的產(chǎn)物，如醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)以及工程學(xué)[5],其研究逐漸趨向白熱化階段[6]。

2 CAP應(yīng)用的安全性與耐受性

Kos等[7]將APPJ發(fā)生器用于小鼠的皮膚創(chuàng)傷模型。結(jié)果顯示：在一定的處理時(shí)間及處理劑量下，CAP治療安全有效，但是較長時(shí)間的CAP治療會(huì)引起直接皮膚損害；當(dāng)不斷增加氦氣釋放，CAP照射的皮膚表面溫度逐漸升高，同時(shí)關(guān)鍵性物質(zhì)“活性氮(RONS)”的含量會(huì)增加[7]。

Daeschlein等[8]研究了3種不同來源的等離子體，研究選擇健康男性志愿者，予以CAP處理手指部位(3～240秒/次，連續(xù)3天)，檢測其皮膚濕度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有等離子體治療均不會(huì)損傷皮膚屏障，也不會(huì)使得皮膚干燥[8]。 Isbary等[9]在一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究中，利用CAP治療24例皮膚慢性感染創(chuàng)面患者，每天治療2 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論細(xì)菌種類如何，與對(duì)照組相比，等離子體處理后的傷口細(xì)菌增殖率顯著降低(P<0.016)，并且所有患者在治療過程中均無副作用發(fā)生，治療的耐受性良好[9]。上述研究表明，無論是在動(dòng)物疾病模型，還是在臨床皮膚疾病方面，CAP均可在一定的時(shí)間及劑量內(nèi)達(dá)到有效的治療效果，同時(shí)并不會(huì)對(duì)機(jī)體其他的正常組織與結(jié)構(gòu)造成損傷。

大量文獻(xiàn)證明，CAP具有促進(jìn)皮膚傷口愈合與組織再生、抗微生物感染、抑制腫瘤生長等作用，并在非感染性皮膚病等治療上展示良好效應(yīng)[2,6]。

3 CAP抑制皮膚傷口的微生物感染

CAP能夠抑制物體表面的微生物感染，包括非生命體表面、生物膜以及被污染或感染組織內(nèi)細(xì)菌及真菌的生長[2]。Maisch等[10]研究了CAP對(duì)于革蘭氏陽性菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感菌)以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的抑制性作用。該研究在6月齡母豬的皮膚表面種植細(xì)菌，然后給予CAP處理。結(jié)果顯示，對(duì)于金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，CAP治療6 min的滅菌率即達(dá)99.9%；對(duì)于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，CAP處理4 min的有效率達(dá)到99.9%。對(duì)照組與CAP處理組(24 h)比較，組織與細(xì)胞未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，沒有明顯細(xì)胞壞死及凋亡?？梢?，CAP不僅能夠抑制普通細(xì)菌的感染，同時(shí)對(duì)具有廣譜耐藥性的耐甲氧西林菌也能夠在數(shù)分鐘內(nèi)滅活，并且有效率高達(dá)99.9%，這為今后利用CAP治療由人體皮膚耐藥菌感染引起的皮膚病提供了可能性。

Mai-Prochnow等[11]認(rèn)為，CAP所產(chǎn)生的包含有活性氧及活性氮的成分會(huì)直接作用于細(xì)胞的細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜：活性氧觸發(fā)了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起Fe-S依賴的脫水酶失活，單核細(xì)胞鐵蛋白破壞以及DNA損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞的失活。Dezest等[12]使用不同組分的載體氣體(氦氣、含有1%氧氣或氮?dú)獾暮?，研究了CAP對(duì)于培養(yǎng)皿中大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果顯示，CAP引起大腸桿菌的死亡，作用機(jī)制一方面可能是CAP引起細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(細(xì)胞膜缺乏及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化)，另一方面可能是氧化應(yīng)激反應(yīng)使得大腸桿菌細(xì)胞相關(guān)蛋白在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及硝基化作用下，發(fā)生了羰基化反應(yīng)，從而使得大腸桿菌細(xì)胞失活，這種抑制效果尤以氧氣作為載體的CAP為著；另外，該研究還發(fā)現(xiàn)活性氧及活性氮并非是引起大腸桿菌死亡的唯一因素，電場及帶電離子也起著非常重要的作用。因此CAP抑制大腸桿菌增殖不僅與等離子體源的載體氣體成分有關(guān)，還與氧化活性物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)[13]。

Heinlin等[14]研究了CAP對(duì)皮膚紅色毛癬菌及犬小孢子菌的作用。從患者頭癬及足癬皮損上提取真菌，接種于培養(yǎng)基上，給予不同持續(xù)時(shí)間及間隔時(shí)間的CAP治療，對(duì)照組給予短波滅菌紫外線照射治療。結(jié)果顯示，CAP處理(每日10 min，連續(xù)9天)可抑制真菌生長而對(duì)照組仍有真菌生長。Maisch等[15]檢測了CAP對(duì)于白色念珠菌的作用，發(fā)現(xiàn)CAP對(duì)白色念珠菌有很強(qiáng)的滅活作用。

Brun等[16]研究了CAP對(duì)于人類皮膚皰疹病毒1型(hHSV-1)與甲型肝炎病毒(HAV)的作用[2]。該研究以氦氣等離子體發(fā)生裝置對(duì)被hHSV-1感染的細(xì)胞進(jìn)行5 min照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被hHSV-1感染的細(xì)胞與對(duì)照組發(fā)生了相同的細(xì)胞病理性改變；但甲型肝炎病毒對(duì)CAP顯示出了更高的敏感性。Brun等認(rèn)為，HAV與hHSV-1的最大區(qū)別就是，HAV缺乏病毒包膜，而Hhsv-1作為雙鏈DNA病毒具有包膜。這樣看來，CAP能否對(duì)病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，可能與病毒是否有包膜相關(guān)。

大量研究證明，CAP抑制微生物感染可能有3種機(jī)制：①微生物細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁的滲透性改變使得合成蛋白質(zhì)的原料無法進(jìn)入細(xì)胞；②活性氧及活性氮的作用導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)被破壞；③CAP直接破壞細(xì)菌的DNA[11，17]。CAP抑制物體表面細(xì)菌感染主要是通過氧化活性物質(zhì)如ROS、RON等的毒性作用；此外，CAP抑制細(xì)菌感染還可能與CAP發(fā)生裝置的載體氣體有關(guān)，例如上述實(shí)驗(yàn)證明，在探究CAP對(duì)大腸桿菌的抑制效果時(shí)，以氧氣為載體氣體的治療有效率要高于以氮?dú)饧昂鉃檩d體氣體的治療有效率[12];但是，CAP對(duì)于細(xì)菌的治療效果評(píng)估還需根據(jù)CAP的作用時(shí)間與作用劑量以及其所治療的疾病種類綜合考慮。大量文獻(xiàn)表明，病毒感染涉及非常復(fù)雜的機(jī)制，包括細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的多種信號(hào)通路，CAP抑制病毒感染的機(jī)制可能與病毒的特殊結(jié)構(gòu)“包膜”有關(guān)，即CAP更有利于無包膜病毒的抑制；然而，CAP對(duì)于真菌的滅活機(jī)制，目前還沒有統(tǒng)一的定論。

4 CAP促使傷口愈合

Hasse等[18]研究了CAP對(duì)于皮膚傷口的影響。該研究從正常人體皮膚上切取直徑為5 mm的組織，予以CAP照射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAP照射1或3 min，細(xì)胞不斷增殖，促使表皮修復(fù)，有利于傷口的愈合；CAP照射3～5 min后，可以觀察到部分細(xì)胞凋亡。Arndt等[19]研究了CAP影響角質(zhì)形成細(xì)胞基因表達(dá)的作用。該研究采用MicroPlaster-β產(chǎn)生CAP，并處理傷口。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAP會(huì)促使編碼白介素(IL)-8、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、TGF-β2的基因表達(dá)；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示，在傷口愈合過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡過程并未受明顯影響。正如上述實(shí)驗(yàn)所述，CAP促使傷口愈合具有時(shí)間依賴性，在一定時(shí)間及劑量內(nèi)CAP可在不影響角質(zhì)細(xì)胞活性的前提下，促使編碼與傷口愈合相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，從而達(dá)到促使傷口愈合的目的。

5 CAP抑制腫瘤的增殖及遷移

Binenbaum等[20]設(shè)計(jì)了一種手持CAP發(fā)生裝置(電壓小于1 200 V)，研究其對(duì)黑色素瘤的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)皆顯示，CAP可以抑制黑色素瘤的發(fā)展。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是皮膚常見腫瘤，盡管已有單克隆抗體療法，但是這類腫瘤的治療方法仍有局限。Welz等[21]研究了CAP對(duì)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的抑制作用,發(fā)現(xiàn) CAP照射(30～180 s)明顯抑制癌細(xì)胞活性，劑量依賴性的DNA破壞可能是CAP抑制腫瘤活性的關(guān)鍵機(jī)制。

Gumbel等[22]證明，CAP會(huì)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)p53 蛋白及其磷酸化增強(qiáng)，還有細(xì)胞核的特征性改變。Gay-Mimbrera等[3]認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)ROS及RNS的含量受到抗氧化物質(zhì)以及清除酶的精細(xì)調(diào)控，RNS參與了許多生物學(xué)活動(dòng)，例如巨噬細(xì)胞功能及含氮氧化物調(diào)節(jié)血管舒張作用等。然而當(dāng)ROS、RNS含量超過體內(nèi)氧化還原反應(yīng)控制系統(tǒng)的平衡能力時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)就會(huì)發(fā)生，其后果是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引起細(xì)胞死亡。正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期不同，引起各自對(duì)氧化應(yīng)激敏感性不同。因此在不破壞正常細(xì)胞情況下，CAP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)RNS，選擇性攻擊腫瘤細(xì)胞，最終引起后者嚴(yán)重破壞甚至死亡。

可見，因腫瘤細(xì)胞對(duì)于氧化應(yīng)激敏感性更高，CAP可通過氧化活性物質(zhì)如ROS、RNS等物質(zhì)破壞腫瘤細(xì)胞DNA，同時(shí)增強(qiáng)p53基因的表達(dá)與磷酸化，進(jìn)而使得p53蛋白抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用增強(qiáng)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖甚至引起腫瘤細(xì)胞死亡。

6 CAP治療銀屑病

Gan等[23]使用APPJ直接處理小鼠銀屑病樣皮炎，同時(shí)用APPJ處理過的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT角質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明，經(jīng)CAP治療的小鼠銀屑病樣皮損較對(duì)照組有明顯好轉(zhuǎn)，并且對(duì)小鼠皮膚的其他結(jié)構(gòu)未見任何損害；經(jīng)APPJ處理過的培養(yǎng)基角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS增加，引起角化細(xì)胞凋亡。

大量文獻(xiàn)表明，IL-12可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞異常活化，引起非感染性炎癥反應(yīng)如角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖，從而參與銀屑病發(fā)病。Zhong等[24]對(duì)CAP治療銀屑病進(jìn)行了基礎(chǔ)研究,采用DBD激發(fā)產(chǎn)生的CAP對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CAP處理2 min，細(xì)胞存活能力基本正常，僅有少許細(xì)胞凋亡；CAP處理3 min，細(xì)胞膜有氣泡產(chǎn)生同時(shí)有部分細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落，細(xì)胞存活能力明顯降低，凋亡細(xì)胞比例增多；繼續(xù)將時(shí)間增至4 min，發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞壞死與凝固，細(xì)胞活性大幅降低，大量細(xì)胞凋亡。CAP照射后，細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、血管內(nèi)皮生長因子明顯增加，而IL-12表達(dá)水平明顯降低。表明CAP促使角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡及相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)IL-12表達(dá)減少，有助于緩解T淋巴細(xì)胞浸潤、炎癥反應(yīng)及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，導(dǎo)致銀屑病皮損損害減輕。上述實(shí)驗(yàn)證明，無論是直接還是間接等離子體源所產(chǎn)生的CAP對(duì)于銀屑病的發(fā)生與發(fā)展均有抑制作用，同時(shí)印證CAP產(chǎn)生的ROS會(huì)促使角質(zhì)形成細(xì)胞的死亡，可能的機(jī)制主要與CAP抑制T淋巴細(xì)胞的浸潤及相關(guān)炎癥因子的異常活化與釋放有關(guān)。

7 結(jié)語

CAP在皮膚病中的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。在保證CAP的安全性及可耐受性的前提下，CAP具有抗細(xì)菌、病毒、真菌感染作用，能夠促進(jìn)皮膚傷口愈合，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，同時(shí)對(duì)銀屑病、瘙癢癥也有望產(chǎn)生療效。雖然已知ROS、RONS及多種細(xì)胞因子參與CAP的治療作用，但是這些因素具體如何相互作用及聯(lián)系，均待進(jìn)一步研究證明。在其應(yīng)用中應(yīng)充分考慮提高療效并避免可能的副作用。隨著相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展，將來對(duì)CAP會(huì)有更為系統(tǒng)、全面的認(rèn)識(shí)，這勢必會(huì)給皮膚病學(xué)帶來不可估量的價(jià)值。