祝娃娃，王健達，張險峰，俞靈鶯

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病之一，PD主要表現(xiàn)為錐體外系運動障礙，其主要特征為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態(tài)異常等運動癥狀，中腦黒質( substantia nigra，SN)致密帶多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的大量丟失是促進帕金森病臨床進展的主要因素[1,2]。但是隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)PD患者還會表現(xiàn)出一系列的非運動癥狀，例如抑郁、焦慮、便秘、認知障礙、睡眠障礙、嗅覺減退等[3,4]。有文獻報道在這些非運動癥狀中，嗅覺減退的發(fā)生率最高，可達到70%～90%[5,6]。既往研究表明，除了在黑質-紋狀體系統(tǒng)存在多巴胺，在嗅球等部位也有分布，很多PD患者嗅覺障礙可能會早于運動癥狀出現(xiàn)[7]。但是目前對PD嗅覺障礙的具體機制尚未完全清楚。本文研究旨在觀察MPTP小鼠的嗅覺障礙以及其與嗅球中DA能神經(jīng)元的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組和處理 健康、雄性C57BL/6J小鼠16只,動物來源：上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物實驗合格證：SYXK(浙)2018-0012，SPF級，體重(20±2) g，隨機分為兩組(n=8)：(1)對照組(control)；(2)模型組(MPTP)。模型組腹腔注射MPTP 14 mg/(kg·次)，一共注射4次，每次需要2 h的間隔時間，要在1 d時間內(nèi)注射完畢(急性模型劑量和給藥)。對照組給予等量的生理鹽水。

1.2 行為學觀察 各組小鼠在MPTP急性給藥14 d后進行運動能力及嗅覺功能的行為學檢測。

轉棒實驗(rotarod test)：將小鼠從清潔級動物房轉移到動物實驗操作間，放置60 min讓小鼠適應環(huán)境。打開轉棒裝置，將旋轉杠的速度調(diào)節(jié)到20 r/min。然后將小鼠放置在旋轉桿上，小鼠從旋轉桿上掉落的時間即為潛伏期，記錄該時間。并且設定最長的潛伏期為300 s。在計算時取3次測試的平均數(shù)。測試完小鼠后將其轉移到清潔級動物房，并且用70%的酒精擦干凈轉棒裝置。埋藏餅干實驗(Buried pellet test)：一個干凈的籠盒(45 cm×24 cm×20 cm)，然后將干凈的墊料均勻的鋪在籠盒的上面，大約 3 cm厚。再將實驗用餅干埋藏在墊料之下，大約0.5 cm，使餅干完全看不見。將小鼠放在實驗籠盒中的正中央，按下計時器開始計時。當小鼠找到餅干并且開始吃的時候按下計時器停止計時，這段時間則是小鼠尋找餅干的時間，記錄此數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析。若小鼠在300 s內(nèi)都沒有找到餅干，則停止計時，并記下時間300 s。木塊實驗(Block test)：準備好實驗用木塊(2 cm×2 cm×2 cm)，分別裝在各自的袋子中，每個袋子只能裝一個木塊，然后從每籠小鼠的籠盒中分別取出8 g的墊料填滿各自的袋子中室溫過夜。在實驗區(qū)域放上兩個木塊，一個木塊帶有接受測試小鼠自身籠盒墊料的氣味；另一個則是帶有不同氣味的木塊。將小鼠放在實驗籠盒中的正中央，按下計時器開始2 min的錄像。觀看錄像，分別數(shù)出小鼠嗅帶有自身籠盒墊料氣味的木塊時間(own scent)，和嗅帶有不同氣味墊料的木塊時間(novel scent)，用novel scent/own scent的比值作為數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 動物取材 動物經(jīng)生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定后，取嗅球在多聚甲醛中固定1 d，再移入5%、85%、95%、100%、100%酒精，由低濃度到高濃度脫水。然后將組織放入二甲苯中脫水，最后用石蠟包埋，切取4 μm厚的冠狀平面的片子。

1.4 免疫組織化學技術 二甲苯脫蠟兩次，每次10 min。再用酒精梯度水化，依次為100%、100%、95%、85%、75%，水化時間分別是10 min、10 min、5 min、5 min、5 min。用PBS漂洗3次，每次5 min，再將玻片放置在檸檬酸緩沖液中微波抗原修復95 ℃～98 ℃，保持時間為20 min。自然冷卻切片，用PBS漂洗3次，每次5 min。使用3%過氧化氫阻斷過氧化物酶的作用，孵育時間15 min。之后先用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl一抗于組織上，放在4 ℃冰箱中。第2天，取出切片。用PBS 漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB試劑盒中的A液，在室溫下孵育60 min。孵育完成后，用PBS漂洗3次，每次5 min。每片切片滴加100～200 μl DAB試劑盒中的顯色液，室溫顯色2～3 min。使用蘇木精染核數(shù)秒至十幾秒，流水沖洗30 min。酒精梯度脫水，從低濃度到高濃度，依次為75%、85%、95%、100%、100%;水化時間分別是5 min、5 min、5 min、10 min、10 min。再用二甲苯通透兩次，每次10 min。最后用中性塑膠封片。

1.5 免疫印跡技術 使用12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。使用恒定電壓進行電泳，當樣品在濃縮膠的時候使用的電壓一般為80～90 V，當樣品在濃縮膠的時候使用的電壓一般為100～120 V。電泳結束后準備轉膜。把轉膜槽放在低溫環(huán)境中330 mA轉膜90～120 min。轉膜之后用 PBST 洗3×5 min。再放入到5%的脫脂牛奶中封閉1 h。然后敷一抗TH (1∶500)、β-actin(1∶5000)，在4 ℃過夜。第2天，在室溫下用PBST 洗膜，3×10 min。加入與一抗所相對應的二抗(1∶2000)，在室溫下充分孵育2～3 h，再用PBST洗膜，3×10 min，室溫。最后將ECL底物顯色A、B 液以1∶1混合，加到膜的表面，反應1 min。把膜放在凝膠電泳儀上成像，適當調(diào)整曝光時間。得到所需蛋白的熒光成像圖。

1.6 細胞計數(shù) TH陽性細胞的計數(shù)在光鏡下分析，陽性細胞為細胞漿染成棕褐色。每個樣本從中挑取3～4片計數(shù)，取其平均值。

2 結 果

2.1 行為學結果 實驗第14天進行行為學觀察，MPTP組小鼠出現(xiàn)明顯的行為學障礙。MPTP小鼠的運動能力顯著下降(見圖1A)。MPTP小鼠的嗅覺察覺和分辨能力也都發(fā)生了明顯的下降(見圖1B、圖1C)，各組小鼠n=6。

圖1 行為學觀察MPTP組小鼠出現(xiàn)明顯的行為學障礙。圖1A顯示MPTP小鼠的運動能力顯著下降;圖1B和圖1C分別顯示MPTP小鼠的嗅覺察覺和分辨能力也都發(fā)生了明顯的下降；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs 相應的對照組，數(shù)據(jù)以表示(n=6)

2.2 TH陽性神經(jīng)元在嗅球中的表達 我們利用免疫組化實驗直觀的觀察了嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的變化。顯示的是對照組和MPTP組小鼠嗅球中的TH陽性神經(jīng)元(見圖2A、圖2B)。兩組小鼠嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的統(tǒng)計(見圖2C)，各組小鼠n=3。

圖2 免疫組化實驗觀察嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的變化。如圖2A和圖2B分別顯示的是對照組和MPTP組小鼠嗅球中的TH陽性神經(jīng)元;圖1C則是對兩組小鼠嗅球中DA能神經(jīng)元數(shù)量的統(tǒng)計，MPTP小鼠模型嗅球部DA能神經(jīng)數(shù)較生理鹽水組顯著增多；*P<0.05 vs 相應的對照組，數(shù)據(jù)以表示(n=3)

2.3 MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白水平升高 我們用免疫印跡的方法進一步驗證了MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白表達水平也是升高的(見圖3)，各組小鼠n=3。

圖3 免疫印跡的方法檢測MPTP組小鼠嗅球中的TH蛋白表達水平。如圖3A、3B。MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表達較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)；*P<0.05 vs 相應的對照組，數(shù)據(jù)以表示(n=3)

3 討 論

帕金森病是一種臨床上常見的進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征為中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，致紋狀體DA含量下降[8]。以往研究表明，在帕金森病的非運動癥狀中嗅覺障礙發(fā)病率極高，嗅覺功能障礙是帕金森病的一個早期、常見的特征，通常發(fā)生在運動癥狀之前數(shù)月甚至數(shù)年[9]。PD的嗅覺障礙主要表現(xiàn)在氣味識別、氣味辨別、氣味記憶等各個方面，但在不同的PD患者中又存在著差異[10]。嗅覺障礙與PD的疾病進展和疾病嚴重性分級有關，其中氣味辨別能力高低也與PD的嚴重程度相關，嗅球是嗅覺通路的重要樞紐，DA作為一種神經(jīng)遞質，除了廣泛存在于黑質-紋狀體系統(tǒng)中，在嗅球等其他部位也有分布[11,12]，這就提示帕金森病可能存在嗅球多巴胺能神經(jīng)元的異常。

目前帕金森病并發(fā)嗅覺障礙的發(fā)病機制尚不清楚。Galvi[13]通過行為學等檢測方法對帕金森病患者的嗅覺功能進行測定，認為患者嗅覺功能的減退與其認知功能有關。既往研究顯示，早期帕金森病患者嗅球內(nèi)小球周細胞中TH陽性細胞數(shù)量約為正常對照組的兩倍，提示早期帕金森病患者嗅覺喪失可能與嗅球代償性DA增加有關。但隨著疾病的進展，代償效應消失后嗅球DA神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少[14,15]。同樣類似的報道出現(xiàn)在MPTP誘導的靈長動物模[12]。此外,有研究表明嗅球中多巴胺表達量的顯著升高也有可能是其針對黑質中多巴胺能神經(jīng)元丟失后的一個快速代償反應，在紋狀體也有類似的代償反應[16,17]。這個也可以解釋左旋多巴治療后并沒有改善PD患者嗅覺障礙的原因。研究發(fā)現(xiàn)側腦室室管膜下區(qū)(SVZ)是神經(jīng)再生發(fā)生的主要區(qū)域之一,產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞通過嘴側遷移流(RMS)通路運輸至嗅球進而對嗅覺損傷部分進行修復。據(jù)報道，紋狀體多巴胺能去神經(jīng)化后SVZ增殖減少，嗅球中多巴胺神經(jīng)元數(shù)量代償性增加[18]。綜合以上所述我們可以認為嗅球部神經(jīng)元數(shù)目及遞質改變可能與嗅覺障礙有關系，故需要實驗研究來進一步證實。

建立理想的模型對于探索發(fā)病機制、尋求藥物治療是極為重要的。MPTP小鼠模型是目前應用最廣泛的PD模型,以往的研究已證實MPTP 小鼠模型在組織化學和生物化學上均符合臨床 PD的特征,是一種較理想的PD模型[19]。在本次實驗中我們利用木塊實驗來考察小鼠對氣味辨別的能力。我們發(fā)現(xiàn)與MPTP組小鼠相比，生理鹽水對照組小鼠明顯更加喜愛去嗅沾染了不同于自己籠盒內(nèi)墊料氣味的木塊，即這些小鼠具有較強的嗅覺分辨能力。同樣我們采用了一種十分普遍且簡單的方法，即埋藏餅干實驗來檢測小鼠的嗅覺察覺能力。我們的結果顯示MPTP組的小鼠需要比對照組花費更多的時間來尋找埋藏的餅干，這表明MPTP小鼠嗅覺察覺閾值升高了。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是多巴胺合成的限速酶,可作為多巴胺能神經(jīng)元的標志,我們對TH+細胞的檢測能直接反映出DA能細胞數(shù)量。我們用免疫熒光標志出TH陽性細胞數(shù)表示多巴胺能神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠模型嗅球部DA能神經(jīng)數(shù)較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義。同時我們免疫印跡檢測TH蛋白發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠模型嗅球部TH蛋白表達較生理鹽水組顯著增多(P<0.05)，有統(tǒng)計學意義。可見帕金森病小鼠嗅覺障礙與嗅球部DA能細胞增加有關，為帕金森病并發(fā)嗅覺功能障礙提供了佐證。但嗅覺系統(tǒng)是疾病發(fā)生和發(fā)展的重要途徑道，同時也是治療干預的早期和可達窗口。未來我們可以進一步研究帕金森病小鼠嗅覺障礙是通過什么機制上調(diào)TH蛋白的表達，為尋求有效的藥物治療提供幫助。