劉海平，吳玉芬，吳梁瑩，張敬虎，張國廣*

（1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000；2.閩臺特色園林植物福建省重點實驗室，福建漳州363000）

目前人們對良好生態(tài)環(huán)境的要求越來越高，食品工業(yè)生產(chǎn)單位都加大了對排放三廢的治理.學(xué)校實驗室是教學(xué)單位開展教學(xué)和研究工作的重要場所，在教學(xué)實驗開展過程中也面臨著三廢的處理問題.在生物學(xué)和食品相關(guān)實驗中，使用考馬斯亮藍G-250（后文簡稱G-250）對蛋白質(zhì)進行定量測定是一種適用廣泛的經(jīng)典實驗方法.G-250測試溶液主要是由考馬斯亮藍G-250，乙醇，85%（W/V）的磷酸和蒸餾水配置而成[1]，實驗后產(chǎn)生的廢液色度大，pH值低，若直接排放將對環(huán)境產(chǎn)生不利影響.

次氯酸鈉是弱酸鹽，分子式NaClO，分子量74.44，室溫呈現(xiàn)無色或淡黃色的液體，有類似氯氣的刺激性氣味，其溶液屬于一種復(fù)雜不穩(wěn)定的化學(xué)系統(tǒng).次氯酸鈉作為一種強烈的氧化劑，可以破壞有機色素基團，從而使有色物褪色，因此被應(yīng)用到一些有色廢液的脫色處理中[2-4]，但尚未有次氯酸鈉對實驗室G-250廢液的脫色研究報道.本研究擬優(yōu)化次氯酸鈉對G-250廢液脫色處理條件，為該廢液的無害化處理提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和藥品

材料：G-250廢液是動物營養(yǎng)、生物科學(xué)、園藝等專業(yè)進行生物化學(xué)實驗教學(xué)中產(chǎn)生的廢液，該方法按照文獻[1]考馬斯亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度的步驟開展，教學(xué)實驗產(chǎn)生的廢液按照要求進行單獨收集.

儀器：TP-114電子天平丹佛儀器；STARTER 3100 pH計奧豪斯儀器；T9紫外可見分光光度計普析通用；TGL-16臺式高速離心機湘儀儀器.

藥品：考馬斯亮藍G-250（A.R）、95%乙醇（A.R）、85%（W/V）磷酸（A.R）、牛血清白蛋白、硫酸亞鐵（A.R）、30%H2O2（A.R）、NaOH（A.R）、高鐵酸鉀（A.R）等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司.次氯酸鈉溶液 次氯酸鈉含量（以有效氯計算）≧8.0%購自西隴化工股份有限公司.

1.2 實驗方法

在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上探討次氯酸鈉溶液投加量、脫色反應(yīng)時間和pH 對G-250 廢液脫色的影響，同時測定了G-250光譜、G-250結(jié)合蛋白后光譜.

1.2.1 NaClO溶液的投加量對G-250廢液降解效果的影響

在室溫條件下，取5 支試管，分別加入10 mL 的G-250 廢液，再每支試管分別依次加入5、7.5、10、12.5、15 μL 的次氯酸鈉溶液，震蕩搖勻.脫色反應(yīng)10 min 后，離心，依次測定并記錄反應(yīng)后溶液的OD 值，計算脫色率.

1.2.2 不同pH值對G-250廢液降解效果的影響

在室溫條件下，取若干G-250廢液測定原始溶液的pH值，取5支試管，分別加入10 mL的G-250廢液，其它反應(yīng)條件保持一致，分別調(diào)節(jié)廢液的pH值為2、3、4、5、6，再依次加入7.5 μL的次氯酸鈉溶液，震蕩搖勻.反應(yīng)10 min后，離心，依次測定并記錄反應(yīng)后溶液的OD值，計算脫色率.

1.2.3 反應(yīng)時間對次氯酸鈉溶液降解效果的影響

在室溫條件下，調(diào)節(jié)G-250廢液pH為4，取5支試管，分別加入10 mL的pH為4的G-250廢液，再分別加入7.5 μL 的次氯酸鈉溶液，震蕩搖勻.分別反應(yīng)5、10、15、20、25 min 后，離心，依次測定并記錄反應(yīng)后溶液的OD值.計算脫色率.

1.2.4 脫色率的計算

次氯酸鈉的氧化降解G-250 廢液效果主要以脫色率大小體現(xiàn).脫色率=（A0?A）／A0×100%，式中：A0—廢液處理前的吸光度；A—廢液處理后的吸光度.

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，把G-250 廢液的脫色率作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 實驗的設(shè)計原理，應(yīng)用Design Expert 8.0 軟件設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面實驗，檢驗NaClO 溶液的投加量、脫色反應(yīng)時間、pH 及因素間交互作用對G-250廢液的脫色率的影響，以+1，0，?1分別代表自變量的高、中、低水平，見表1.

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Tab.1 Level table of response surface analysis factor

1.3 次氯酸鈉降解G-250廢液的原理

紫外可見光光譜：使用紫外可見光分光光度計掃描用次氯酸鈉脫色過的G-250廢液，在次氯酸鈉脫色過的廢液中按照體積比10︰1的比例加入5%的高鐵酸鉀，振蕩30 min后再次掃描記錄光譜變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 G-250及其結(jié)合蛋白質(zhì)后的光譜

圖1中曲線1和2分別表示在200～800 nm之間，G-250和G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后的光譜.在可見光區(qū)域內(nèi)，G-250 在465 nm 和650 nm 處有兩個波峰，G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合之后，在640 nm 處有最大吸收峰值，但此處在G-250 第二個波峰的附近，為了盡可能減少G-250 自身的干擾，蛋白質(zhì)濃度測定時選取595 nm，此波長處G-250自身吸光值處于一個低點，G-250結(jié)合蛋白質(zhì)后的吸光值處于相對的高峰，盡可能的降低了游離G-250的干擾，光譜掃描結(jié)果和文獻[5]相符合.

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 NaClO溶液的投加量對G-250廢液脫色效果的影響

本實驗結(jié)果（圖2）表明：NaClO 溶液的投加量對G-250廢液脫色率有較大影響，隨著NaClO 溶液的投加量的增加，G-250 廢液脫色率逐漸升高.當(dāng)投加量大于10μ L 后廢液脫色率逐漸趨于平緩.當(dāng)NaClO 溶液的投加量為7.5μL 時的脫色率已高達93.11%，廢液幾乎變?yōu)闊o色.在后面的單因素試驗中，NaClO 溶液的投加量均取7.5μL.

圖1 G250、G250 結(jié)合蛋白、次氯酸鈉處理G250 廢液和處理后廢液加入高鐵酸鉀處理后光譜圖Fig.1 Spectra of G250， G250 binding protein， sodium hypochlorite treatment G250 waste liquid and discolored waste liquid added with potassium ferrate

圖2 NaClO的投加量對G-250廢液脫色效果的影響Fig.2 Effect of dosage of NaClO on decolorization of G-250 waste liquid

2.2.2 不同pH對G-250廢液脫色效果的影響

G-250 廢液pH 值約在1～2 之間，但不同批次收集的廢液因?qū)嶒炦^程中清洗比色皿等原因，其pH 有所波動.脫色處理結(jié)果表明，pH 對次氯酸鈉脫色有較大影響（圖3），在pH 為4 時，脫色率最佳，可達97.48%.其原因可能在于：pH為4時，NaClO主要以HClO形態(tài)存在，而HClO放出的新生氧具有很強的氧化作用；pH大于4時，主要以NaCIO形態(tài)存在，二種分子氧化能力不同[2].考慮到處理完的廢液，pH要調(diào)到中性才能排放，故pH選取4比較合適.

2.2.3 脫色反應(yīng)時間對次氯酸鈉廢液脫色效果的影響

本組實驗結(jié)果（圖4）表明：隨著反應(yīng)時間的增加，G-250 廢液脫色率逐漸增加，反應(yīng)時間為10 min 時的脫色率可以達到80.21%.

圖3 pH對G-250廢液脫色效果的影響Fig.3 Effect of pH on the decolorization effect of G-250 waste liquid

圖4 反應(yīng)時間對G-250廢液脫色效果的影響Fig.4 Effect of reaction time on the decolorization of G-250 waste liquid

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化G-250廢液脫色率的結(jié)果

2.3.1 回歸模型的建立與分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，將NaClO 溶液的投加量、反應(yīng)時間、pH 值進行三因素與三水平中心組合實驗，利用Box-Benhnken 中心組合實驗的設(shè)計原理，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化G-250 廢液脫色、設(shè)計，進行17 次試驗，其中析因試驗共計12 次，中心組合試驗共計5 次重復(fù).實驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2，相應(yīng)的方差分析數(shù)據(jù)見表3.

應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程：Y=85.80+4.87A+2.06B ?2.20C+3.37AB+3.24AC+2.36BC ?3.25A2?2.97B2?2.19C2.根據(jù)表3的方差分析可以得出，該模型極顯著（p＜0.01），預(yù)測值和試驗值有相關(guān)性；失擬項不顯著(p=0.601 3＞0.05)，表明殘差均由隨機誤差所引起，該模型對G-250廢液脫色率實際值與預(yù)測值有很好的擬合度，可以利用該模型對G-250 廢液脫色率進行較好地分析、預(yù)測及確定G-250 廢液脫色率最佳的反應(yīng)條件.從表3還可以看出：3個因素對G-250廢液脫色率有顯著影響.而由相應(yīng)pH 值可看見，對G-250廢液脫色率影響的大小順序為：次氯酸鈉投加量＞pH＞反應(yīng)時間.

2.3.2 G-250廢液脫色率響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)曲面反映了氯酸鈉投加量、脫色反應(yīng)時間和pH 三個因素中的其中一個變量取零點水平時，另外兩個因素交互作用對G-250 廢液脫色率的影響情況（圖5—7）.曲面陡表示該因素對脫色率的影響顯著，曲面平緩表示該因素對脫色率的影響不顯著[6-7]；等高線形狀則反映兩因素交互作用的強弱，橢圓形表示交互作用強，影響顯著，圓形則相反[6-7]；等高線密集表示對脫色率影響較大，稀疏表示影響較小[6-7].從圖中可看出次氯酸鈉投加量比pH、反應(yīng)時間的曲線陡峭，說明次氯酸鈉投加量對G-250 廢液脫色率的影響最大；三組三維圖的投影（即等高線）呈橢圓狀，表明兩因素的交互作用對脫色率的影響顯著，同回歸方差分析的結(jié)果（表3）一致.

2.3.3 最佳工藝的預(yù)測與驗證

應(yīng)用Design-expert 8.0軟件的optimization功能，把G-250廢液脫色率的目標(biāo)選項設(shè)定成maximize，取得一個最優(yōu)的方案：10 mL的G-250廢液體系中次氯酸鈉投加量10 μL、反應(yīng)時間15 min、pH 為4.78，此時的理論脫色率達91.19%.考慮到實際操作的便利，將優(yōu)化方案設(shè)置為：次氯酸鈉投加量10 μL，反應(yīng)時間15 min，pH為5，進行了五次驗證試驗所得的G-250廢液脫色平均得率為92.55%，與預(yù)測值之間的相對偏差為1.36%，表明用響應(yīng)面法對G-250廢液脫色的3個因素進行優(yōu)化研究是可行的.

圖5 反應(yīng)時間與次氯酸鈉投加量交互作用響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction between reaction time and sodium hypochlorite dosage

圖6 pH與次氯酸鈉投加量交互作用響應(yīng)面Fig.6 Response surface of interaction between pH of solution and sodium hypochlorite dosage

2.4 次氯酸鈉氧化褪色G-250廢液的原理

G-250 廢液被次氯酸鈉溶液氧化脫色后掃描到的光譜（圖1線3）表明，在400～800 nm 的可見光區(qū)域內(nèi)，沒有吸收峰的出現(xiàn)，因此次氯酸鈉法可以使G-250 廢液脫色.在紫外區(qū)240 nm 和290 nm 處分別出現(xiàn)了光吸收峰，240 nm處的光吸收波峰出現(xiàn)，說明溶液中有苯環(huán)結(jié)構(gòu)存在，290 nm處的波峰說明化合物具有較大的共軛體系[8].觀察用高鐵酸鉀處理脫色后的廢液測得的光譜圖（圖1線4）在290 nm 處的波峰消失，且240 nm處的光吸收值也大大降低，因為高鐵酸鉀可以使苯環(huán)開環(huán)，生成的產(chǎn)物主要有順丁烯二酸、反丁烯二酸、草酸和甲酸[9-11]，這些小分子化合物在240 nm處幾乎沒有光吸收.

圖7 pH與反應(yīng)時間交互作用響應(yīng)面Fig.7 Response surface of interaction between pH of solution and reaction time

圖8 G-250結(jié)構(gòu)圖及其可能被降解化學(xué)鍵示意圖Fig.8 G-250 structure diagram and its possible degradation of chemical bonds

由以上分析推測次氯酸鈉優(yōu)先攻擊考馬斯亮藍G-250 分子結(jié)構(gòu)[12]中的三個帶電N 原子處（圖8較粗的黑色箭頭所示），作為氧化劑，帶電子的N 原子處是最容易因失去電子而被氧化的，從而化學(xué)鍵被打斷，也應(yīng)該能夠攻擊核心的C 原子（圖8較細綠色箭頭所指）和三個苯環(huán)結(jié)構(gòu)形成的共價鍵，主要生成一些游離的帶苯環(huán)結(jié)構(gòu)的分子和部分仍然連接在核心C 原子上的三個苯環(huán)的大的共軛結(jié)構(gòu)分子，因此在光譜掃描中在240 nm和290 nm處有2個吸收波峰存在.用高鐵酸鉀處理后290 nm處的吸光值消失，表明高鐵酸鉀不但能夠打開單個游離的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，也能夠氧化斷裂與核心C 原子連接的3個共價鍵（圖8較細箭頭所指），使原來具有較大共軛結(jié)構(gòu)的大分子變成游離的單苯環(huán)結(jié)構(gòu)的分子，從而導(dǎo)致處理后廢液的290 nm處的吸收峰消失.

因此G-250 廢液在次氯酸鈉的氧化下，色素分子分解生成了游離的含苯環(huán)的分子，這樣考馬斯亮藍G-250的結(jié)構(gòu)被破壞，從而達到脫色的目的.但脫色的廢液中還富含具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的分子，該脫色后廢液是否具有生物毒性還需要進一步探究.

3 結(jié)論

次氯酸鈉法氧化降解G-250 廢液具有脫色效果好，操作經(jīng)濟簡單等優(yōu)點.根據(jù)單因素實驗及響應(yīng)曲面分析優(yōu)化的反應(yīng)條件，結(jié)合實際操作確定氧化降解G-250廢液的最佳條件為：10 mL的廢液體系中次氯酸鈉投加量為10 μL，反應(yīng)時間為15 min，pH 為5，此時的脫色率最高，結(jié)果可為考馬斯亮藍G-250 廢液的脫色提供參考依據(jù).經(jīng)光譜掃描后可知脫色后的廢液仍然具有大量含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物分子，還需要進一步的無害化處理.