胡賢鋒，王 健，李 明，李榮玉，3

(1.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550025)

稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性態(tài)為Villosiclavavirens，無性態(tài)為Ustilaginoideavirens)侵染水稻小穗引起的穗部病害[1]。近年來，由于我國雜交水稻大面積推廣和稻田肥水水平提高，稻曲病由歷史上的次要病害演變?yōu)楫?dāng)前水稻生產(chǎn)上“新三大病害”之一[2]。此外，稻曲病不僅危害糧食產(chǎn)量，稻曲病菌產(chǎn)生稻曲菌素對動物微管蛋白組裝和細(xì)胞有絲分裂具有較強(qiáng)抑制作用，嚴(yán)重影響稻米食用安全[3-4]。由于稻曲病研究起步晚，稻曲病菌在人工培養(yǎng)條件下菌絲生長十分緩慢，加之稻曲球為唯一可見病狀，發(fā)病受氣候條件影響大，且其侵染機(jī)制獨(dú)特等制約了稻曲病深入研究，導(dǎo)致關(guān)于稻曲病的諸多理論問題不明晰，特別是侵染循環(huán)過程中初侵染源、侵染機(jī)制等存在爭議[5-7]。研究人員在定量抗性位點(diǎn)分析等方面做了大量工作，但未鑒定出抗稻曲病菌水稻抗性基因[8-9]。因此，當(dāng)前對稻曲病仍缺乏抗性較好的品種。鑒于此，從稻曲病菌的接種體系、初侵染源、侵染關(guān)鍵期、侵染位點(diǎn)、侵染過程、侵染機(jī)制等方面對國內(nèi)外的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步明確稻曲病菌致病機(jī)制，并為稻曲病抗性品種選育、防控藥劑特異性靶標(biāo)選擇以及防控策略制定等提供理論參考。

1 水稻稻曲病發(fā)生與危害

稻曲病1878年在印度首次被報道，而在我國明朝就有“硬谷奴，谷穗霉者”的記載，實際就是對稻曲病的最初認(rèn)識[10]。該病害在孟加拉國、日本、中國等40多個國家的水稻主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[11-14]。稻曲病在我國各稻區(qū)普遍發(fā)生，但每年發(fā)生嚴(yán)重程度差異較大，主要由于該病發(fā)生常受氣候、品種及栽培等因素影響[15]。稻曲病產(chǎn)生稻曲球?qū)е滤臼崭顣r夾雜大量病粒，同時稻曲病菌劫持水稻營養(yǎng)物質(zhì)形成稻曲球，致使秕谷增多，千粒質(zhì)量下降，減產(chǎn)10%～50%[16]。稻曲病菌主要產(chǎn)生黑粉菌素和綠核菌素2類次生代謝產(chǎn)物[17]。現(xiàn)已在稻曲菌中分離鑒定了 26 種黑粉菌素：黑粉菌素 A、B、B1、C、D、E、E1、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W和3，4-二氫黑粉菌素T[18-19]。其中，黑粉菌素是一類可破壞真核生物有絲分裂的水溶性無色物質(zhì)，對動植物細(xì)胞具有毒性，研究人員將稻曲球研磨成粉末拌飼料飼喂后，能夠?qū)е码u、兔內(nèi)臟器官病變[20-21]。

2 水稻稻曲病菌侵染行為

2.1 水稻稻曲病接種體系構(gòu)建

當(dāng)前，缺乏高效穩(wěn)定引發(fā)稻曲病的人工接種技術(shù)仍是限制稻曲病深入研究的重要因子。迄今，多數(shù)研究者認(rèn)為，在水稻破口前7 d，通過注射器將菌絲孢子混合液注入水稻穗苞并作保濕處理能夠引發(fā)稻曲病。張君成等[22]通過人工接種稻曲病菌，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)獲得薄壁分生孢子可引發(fā)稻曲病，分生孢子濃度越高，病穗率越高。其中，孢子菌絲混合液接種發(fā)病最嚴(yán)重，病穗率高達(dá)100%，最大病情指數(shù)為93.96%。LU等[23]的研究也表明，采用高速勻漿機(jī)將稻曲病菌菌絲和孢子打碎，制備菌絲孢子混合液，可引發(fā)稻曲病。因此，當(dāng)前大多數(shù)研究人員采用稻曲病菌菌絲孢子混合液作為接種體。此外，JIA等[24]在室內(nèi)控制條件下進(jìn)行人工接種試驗，比較不同幼穗分化期、溫度、保濕時間等對發(fā)病率的影響，發(fā)現(xiàn)幼穗分化后期接種稻曲病菌發(fā)病率最高，同時，溫度和濕度對稻曲病發(fā)病率影響較大，28 ℃條件下病穗率顯著高于20 ℃。ASHIZAWA等[25]也報道，溫度和濕度是引發(fā)稻曲病的重要因子，室內(nèi)人工接種后16 ℃保持2 d，然后在100%濕度條件下保濕5 d，最有利于稻曲病發(fā)生。而胡東維等、WANG等[26-27]將白化菌株注射入水稻穗苞，其發(fā)病率顯著高于噴霧接種，并且適當(dāng)?shù)牡蜏卮碳つ軌虼龠M(jìn)稻曲病的發(fā)生。在室內(nèi)控溫控濕條件下，用注射器將稻曲病菌分生孢子液注入水稻穗苞常具有較高發(fā)病率，但該方法并不能真正意義上模擬稻曲病菌田間自然侵染，難以解釋田間稻曲病菌的真正侵染途徑，不能真實反映水稻品種對稻曲病菌的抗性水平，因此，建立高效穩(wěn)定的可模擬田間自然侵染的稻曲病菌人工接種體系，對研究其侵染途徑及水稻抗性品種選育具有重要意義。

2.2 水稻稻曲病初侵染源

關(guān)于稻曲病菌的主要初侵染源尚存在爭議。菌核在適宜條件下可萌發(fā)形成子座，子座產(chǎn)生子囊孢子，進(jìn)而萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子；厚垣孢子在適宜條件同樣可產(chǎn)生分生孢子。菌核、厚垣孢子及種子帶菌引發(fā)稻曲病均有報道[28-30]。有研究人員認(rèn)為菌核是稻曲病菌主要的初侵染源：菌核越冬后在適宜的溫濕度條件下萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子侵染水稻花器官，厚垣孢子主要在稻曲病菌再侵染過程中起重要作用[31]。YONG等[32-33]研究發(fā)現(xiàn)，亞熱帶稻曲病菌可產(chǎn)生大量菌核，且單個稻曲菌便可產(chǎn)生大量子囊孢子，所以，即使僅有少量菌核萌發(fā)，也可產(chǎn)生大量初侵染源；此外，水稻抽穗時，利用孢子捕捉器可在溫帶和亞熱帶捕捉到子囊孢子。另有研究人員認(rèn)為厚垣孢子才是主要的初侵染源，在我國河北等地很少發(fā)現(xiàn)菌核，且菌核在土壤中易潰爛[34]。IKEGAMI[35]用厚垣孢子接種水稻穗苞，能夠?qū)е滤景l(fā)病。姚琳等[36]將稻曲球分別置于4、-20 ℃條件下，8個月后檢測其萌發(fā)率，4 ℃條件下保存的厚垣孢子萌發(fā)能力較強(qiáng)，可成為來年初侵染源。高必達(dá)等[37]認(rèn)為田間越冬后的菌核和厚垣孢子是稻曲病的主要初侵染源，菌核和厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子，隨雨水進(jìn)行傳播。劉見平等[38]則認(rèn)為，種子帶菌是稻曲病菌的主要初侵染源?？傊?，形成菌核或厚垣孢子是稻曲病菌越冬的重要方式，厚垣孢子和菌核在適宜的溫濕度條件下均能形成分生孢子，侵染水稻花絲，最終形成稻曲球。因此，可通過調(diào)查越冬后田間菌核或厚垣孢子基數(shù)，或在侵染前期采用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增)等快速檢測方法評估菌源數(shù)量，加強(qiáng)稻曲病的發(fā)生和危害預(yù)測預(yù)報。

2.3 水稻稻曲病侵染時期

明確稻曲病菌最佳侵染時期對確定其防控最佳時期具有指導(dǎo)意義。稻曲病的典型癥狀是在穗部形成稻曲球，故大多數(shù)研究人員認(rèn)為，水稻孕穗期至破口期是稻曲病菌侵染的關(guān)鍵時期，但也有部分研究人員認(rèn)為，稻曲病菌可能在水稻整個生育期潛伏。前人為了摸清稻曲病菌的最佳侵染時期做了大量研究工作。張震等[39]通過對稻曲球解剖，發(fā)現(xiàn)典型的稻曲球均可解剖出完整子房，由此推測稻曲病菌侵染水稻小穗發(fā)生在水稻開花之前，并直接從子房獲得營養(yǎng)形成稻曲球。TANG等[2]也有相似報道，成熟稻曲球中含有6個完整花藥，推測稻曲病菌主要侵染時期可能是在水稻花器官形成之后、水稻揚(yáng)花之前。汪愛娟等[40]在稻株“葉枕平”(即水稻孕穗末期)用藥具有較高防效，由此推測水稻孕穗期可能是稻曲病菌侵染的主要時期。李陽[41]用稻曲病菌在水稻芽期、三葉期、圓稈期和孕穗期進(jìn)行接種試驗，同時用稻曲病特異性PCR進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)自接種后每個發(fā)育時期均可檢測到稻曲病菌的存在，推測稻曲病菌可寄生于水稻體內(nèi)潛伏。陳永堅等[42]用厚垣孢子粗提液處理水稻苗期根系、苗期葉、芽鞘、種子，其病穗率分別為9.68%、2.58%、3.95%、2.04%，推測水稻整個生育期均可受到病原菌侵染。郭榮華等[43]在水稻生長幾個關(guān)鍵時期用厚垣孢子懸浮液分期噴霧，發(fā)現(xiàn)處于破口初期的嫩穎最易遭到侵染，且田間藥劑試驗表明，在破口前7 d施藥防效最高，推測稻曲菌可能的最佳侵染時期是在水稻破口前7 d。大量的人工接種試驗表明，稻曲病菌在幼穗形成后即水稻穗苞破口前7 d為主要侵染時期，這已得到大多數(shù)研究人員認(rèn)可。

2.4 水稻稻曲病侵染過程

為了探明稻曲病菌侵染水稻的過程，研究人員對稻曲病菌菌株進(jìn)行標(biāo)記與追蹤，取得了新突破，發(fā)現(xiàn)稻曲病菌首先附著在水稻穎殼，進(jìn)而侵染相應(yīng)花器官。代光輝等[44]利用熒光顯微鏡對稻曲病菌分生孢子侵染途徑進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)稻曲病菌分生孢子首先在穎口萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，稻曲病菌菌絲沿穎口進(jìn)入穎內(nèi)。蔡洪生等[45]采用稻曲病菌孢子液對水稻進(jìn)行人工接種后，發(fā)現(xiàn)菌絲最先在花絲和花藥上出現(xiàn)，之后才出現(xiàn)在柱頭上。鄭大偉等[46]研究發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌侵入水稻小穗后，首先出現(xiàn)在花藥表面，后擴(kuò)展至小穗基部。ASHIZAWA等[11]采用GFP(Green fluo-rescent protein,綠色熒光蛋白)標(biāo)記菌株接種水稻穗部，實現(xiàn)了對稻曲病菌可視化追蹤觀察，發(fā)現(xiàn)稻曲病菌菌絲可通過水稻穎殼間隙入侵，隨后稻曲病菌開始侵染水稻某些重要花器官。CHAO等[47]將稻曲病菌侵染分為3個階段：稻曲病菌侵染雌蕊和柱頭、擴(kuò)展至雄蕊基部、包裹花器官后進(jìn)入花藥室產(chǎn)孢。雍明麗[48]研究發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌易附著在幼根，在根系表皮細(xì)胞間隙可檢測到稻曲病菌，但30 d后仍未發(fā)現(xiàn)稻曲病菌刺破厚壁組織層進(jìn)入根的韌皮部，說明稻曲病菌很難通過附著在水稻根部進(jìn)而達(dá)到穗部進(jìn)行侵染。SONG等[49]研究發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌的侵染過程是逐步的，稻曲病菌的侵染模式不同于經(jīng)典的稻瘟病菌侵染模式(常以水稻葉片等作為侵染對象)，稻曲病菌通過穎殼間隙進(jìn)入穎內(nèi)后，首先攻擊水稻花絲，阻止水稻花粉的成熟，同時阻斷子房受精后劫持其營養(yǎng)庫進(jìn)而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染過程。然而，稻曲病菌與花絲間的識別機(jī)制和形成稻曲球的營養(yǎng)物質(zhì)來源尚不明晰，揭開稻曲病菌與花絲之間相互識別的生理生化機(jī)制、摸清稻曲病菌如何激發(fā)水稻相關(guān)灌漿基因的表達(dá)進(jìn)而獲取營養(yǎng)物質(zhì)形成稻曲球可能是將來的研究方向。

2.5 稻曲病菌分子生物學(xué)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，稻曲病菌的侵染機(jī)制研究也得到長足進(jìn)步。當(dāng)前，已完成了稻曲病菌全基因組測序，并進(jìn)行了致病相關(guān)基因的克隆與功能以及水稻響應(yīng)稻曲病菌等相關(guān)研究。ZHANG等[50]對標(biāo)準(zhǔn)菌株Uv-8b進(jìn)行測序，完成了標(biāo)準(zhǔn)菌株Uv-8b全基因組序列草圖繪制，通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌基因組中缺乏果膠分解酶基因，這可能與稻曲病菌獨(dú)特的侵染方式有密切關(guān)系，從分子水平解釋了稻曲病菌獨(dú)特的侵染方式，并預(yù)測了193個富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)和628個分泌蛋白，以及與稻曲病菌次生代謝物質(zhì)合成相關(guān)的重要因子。KUMAGAI等[51]對菌株IPU10進(jìn)行全基因組測序，并預(yù)測了6 451個蛋白質(zhì)。全基因組測序的完成為同源基因的克隆與功能研究帶來極大便利。FAN等[12]在接種稻曲病菌后對水稻小穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)調(diào)控水稻灌漿的基因RISBZ1和RPBF等被激活表達(dá)，而調(diào)控水稻開花的轉(zhuǎn)錄因子ARF8和ARF6等被抑制表達(dá)，且與水稻防御相關(guān)的相關(guān)基因NPRI和PRI出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，推測稻曲病菌能夠激活灌漿基因的表達(dá)，從而獲得大量營養(yǎng)物質(zhì)形成稻曲球。研究人員通過比較稻曲病抗性品種IR28和感病品種黃華占接種后的轉(zhuǎn)錄組，在IR28和黃華占上分別找到1 405、1 066個差異表達(dá)的基因，這些差異表達(dá)的基因?qū)^氧化物酶基因的差異性調(diào)控、次生代謝等起到重要調(diào)控作用[52]。當(dāng)前，通過T-DNA隨機(jī)插入的方法，獲得了與稻曲病菌孢子形成和菌絲生長和致病性相關(guān)基因的插入突變體UvSpo76、Uvt-726、UvSUN2、UvT-B1464R和Uvt-1241，并通過定向敲除或RNAi的方法明確了UvHOG1、UvPRO1、Uvt3277和UvSLT2基因的功能。其中，UvSLT2基因主要產(chǎn)孢量與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[53]，UvHOG1參與次級代謝[6]、菌絲生長和應(yīng)激反應(yīng)，UvPRO1和Uvt327參與孢子形成、菌絲生長，與致病性相關(guān)[7，54]。上述研究結(jié)果對于分離水稻抗稻曲病QTL(Quantitative trait locus,數(shù)量性狀基因座)及選育水稻抗性品種具有重要意義。在以后研究工作中可針對稻曲病菌特異性侵染過程研究其功能基因，明確相關(guān)致病基因作用機(jī)制，也是快速摸清稻曲病菌致病機(jī)制的有效途徑。

3 展望

稻曲病已成為我國水稻生產(chǎn)上嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)與產(chǎn)量的重要病害。關(guān)于稻曲病的研究起步較晚，且其發(fā)病受氣候條件影響大，加之稻曲球為唯一可見病狀，其侵染機(jī)制獨(dú)特等因素制約，導(dǎo)致稻曲病相關(guān)研究尚不深入[26，55]。當(dāng)前，人工注射接種是稻曲病菌接種試驗中廣泛運(yùn)用的接種方法，但該方法不能解釋田間稻曲病菌的真正侵染途徑，難以反映水稻品種對稻曲病菌的真實抗性水平。田間稻曲病菌可通過形成菌核或厚垣孢子越冬后萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子形成侵染源，在水稻穗苞破口前7 d從水稻穎殼間隙進(jìn)入穎內(nèi)，通過侵染花絲抑制水稻花粉的成熟，同時阻止子房受精后劫持其營養(yǎng)庫進(jìn)而形成稻曲球，初步揭示了稻曲病菌的侵染過程。與此同時，稻曲病菌全基因組測序已經(jīng)完成，并進(jìn)行了相關(guān)致病基因克隆與功能分析及水稻響應(yīng)稻曲病菌等相關(guān)研究。明確了稻曲病菌侵染行為，對稻曲病抗性品種選育、防控藥劑篩選以及防控策略制定具有重要意義。目前，對稻曲病的研究仍然有許多工作要做，以下幾個方面可作為以后研究方向的參考。

(1)當(dāng)前接種方法并不能真正意義上模擬稻曲病田間自然感病，故難以闡明田間自然發(fā)病真正的侵染途徑。因此，建立高效穩(wěn)定可真正模擬稻曲病菌自然感病的接種體系具有重要意義。

(2)稻曲病菌首先選擇水稻花絲作為攻擊目標(biāo)，但稻曲病菌與花絲之間識別生理生化機(jī)制尚不明了，揭開稻曲病菌與花絲之間的相互識別機(jī)制，可為防控藥劑開發(fā)靶標(biāo)的選擇和防控策略的制定提供依據(jù)。

(3)稻曲病菌能夠產(chǎn)生大量的稻曲菌素，該毒素在稻曲病菌侵染過程中的作用鮮有報道，可研究其在稻曲病菌侵染水稻過程中的作用。

(4)稻曲病菌如何激發(fā)水稻相關(guān)灌漿基因的表達(dá)進(jìn)而獲取營養(yǎng)物質(zhì)形成稻曲球可能是將來的研究方向。

(5)往往在產(chǎn)生稻曲球后才發(fā)現(xiàn)稻曲病已發(fā)生，常導(dǎo)致錯過最佳的防控時期。因此，在侵染前期可使用LAMP等快速檢測方法評估菌源數(shù)量，以加強(qiáng)稻曲病發(fā)生和危害的預(yù)測預(yù)報。