張俊華，馬 玥，楊明秀，宋 爽，劉連夫，楊 碩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

水稻稻曲?。≧ice false smut，RFS）是由稻綠核菌[Ustilaginoidea virens(Cooke) Takahashi]引起的世界性水稻病害[1]，降低水稻產(chǎn)量與品質(zhì)，稻粒被稻曲病菌污染后所含毒素可抑制人、動物細(xì)胞分裂及μ管蛋白功能，對人畜健康造成安全隱患[2-3]。因此，加強(qiáng)稻曲病菌分子生物學(xué)研究，對制定有效的水稻稻曲病防控策略具有重要意義，快速提取高質(zhì)量DNA 是稻曲病菌基因克隆、精細(xì)定位及群體遺傳多樣性分析等分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵。

目前從稻曲病菌中分離基因組DNA 方法主要有：十六烷基三甲基溴化銨法（Cetyl trimethyl ammonium bromid，CTAB）[4]、十 二 烷 基 硫 酸 鈉 法（Sodium dodecyl sulfate，SDS）[5]、試劑盒法[6]和改良脲素法[7]。CTAB法利用CTAB陽離子去污劑將細(xì)胞中DNA 溶解后經(jīng)有機(jī)溶劑抽提去除蛋白、多糖等雜質(zhì)。SDS法中SDS陰離子去污劑在高溫下裂解細(xì)胞膜使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，與蛋白質(zhì)多糖結(jié)合釋放核酸。改良脲素法與SDS試劑配合提取基因組DNA 方法得到的稻曲病菌基因組DNA 量大且質(zhì)量較好。但CTAB 法、SDS 法和改良脲素法操作步驟繁瑣、耗時(shí)長、易造成DNA 鏈斷裂，需接觸有毒試劑，危害操作者健康。當(dāng)涉及群體遺傳多樣性、分子標(biāo)記等需快速大量獲取基因組DNA 的研究時(shí)，CTAB 法、SDS 法和改良脲素法工作量大，試劑盒提取成本高，均無法滿足快速高效、低成本獲取稻曲病菌基因組DNA 的需要。一步式提 取 法（Rapid one-step extraction， ROSE）由Steiner 等首次報(bào)道[8]。傳統(tǒng)ROSE 法采用“一步一管”方式，即磨碎組織后加入ROSE 提取緩沖液90 ℃溫浴后置于冰上，使組織和PVPP 沉淀后4 ℃保存?zhèn)溆眉纯?。該方法簡單、提取快速、成本低廉、無污染，但DNA 濃度與質(zhì)量偏低、保存時(shí)間短，不適用于對DNA 質(zhì)量有較高要求的研究，如基因克隆、基因敲除等。將ROSE法用于提取稻曲病菌基因組DNA尚未見報(bào)道。

國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)不同試驗(yàn)樣本改良DNA 提取方法以滿足不同分子試驗(yàn)要求[9-10]。本試驗(yàn)對ROSE法改進(jìn)后形成“改良ROSE法”，對比傳統(tǒng)稻曲病菌基因組DNA 提取方法，旨在尋找一種可在短時(shí)間內(nèi)快速、高效提取高質(zhì)量稻曲病菌DNA 的方法，滿足稻曲病菌遺傳圖譜構(gòu)建及基因克隆等高質(zhì)量DNA分子試驗(yàn)要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

水稻稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi]UV-WC-1，UV-AC-1，UV-FZ-1 菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室提供。

1.1.2 供試藥劑

CTAB 裂解緩沖液（2%CTAB、1%PVP、1.4 mol·L-1NaCl、pH 8.0 20 mmol·L-1EDTA、pH 8.0 100 mmol·L-1Tris-HCl）；SDS 裂解緩沖液（500 mmol·L-1NaCl、pH 8.0 50 mmol·L-1EDTA、pH 8.0 50 mmol·L-1Tris-HCl）；脲素裂解緩沖液（1%SDS、7 mol·L-1urea、62.5 mmol·L-1NaCl、pH 8.0 50 mmol·L-1Tris-HCl）；ROSE 裂解緩沖液（1%SLS、1%PVPP、pH 8.0 10 mmol·L-1Tris-HCl、pH 8.0 312.5 mmol·L-1EDTA）；TE 緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl、pH 8.0 1 mmol·L-1EDTA）；NaAc（3 mol·L-1pH 5.2）；KAc（5 mol·L-1pH 4.8）；70%乙醇；10%SDS；RNaseA；氯仿/異戊醇（24∶1）；苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）；康為真菌DNA 提取試劑盒（產(chǎn)品目錄號CW0531S）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（PSA）：用于稻曲病菌固體培養(yǎng)；馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基（PS）：用于稻曲病菌震蕩培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲收集

將UV-WC-1、UV-AC-1、UV-FZ-1 稻曲病菌株經(jīng)馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（PSA）培養(yǎng)7 d 后在菌落邊緣取3 塊直徑為5 mm 菌碟置于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基（PS）中28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)7 d，過濾洗滌菌絲后置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 稻曲病菌DNA提取方法

1.2.2.1 CTAB法

參照Ladhalakshmi 等方法，略改進(jìn)[4]。稱取0.1 g 稻曲病菌菌絲于研缽中，迅速用液氮研磨至粉末狀轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中。加入600 μL CTAB裂解緩沖液（預(yù)熱）65 ℃水浴40 min，平均每10 min震蕩搖勻1 次充分裂解菌絲。水浴后加入100 μL KAc 冰浴30 min。加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提兩次。12 000 r·min-1離心10 min 取上清液加入等體積異丙醇（預(yù)冷）-20 ℃冷凍45 min，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液收集沉淀，70%無水乙醇洗滌沉淀2 次，室溫條件下風(fēng)干10 min，加50 μL TE緩沖液和2 μL RNaseA 37 ℃水浴10 min后置于-20 ℃保存。

1.2.2.2 SDS法

稱量0.1 g 稻曲病病菌菌絲于研缽中，液氮冷卻研磨至粉末狀轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中。離心管中加 入400 μL SDS 裂 解緩 沖液 和80 μL 10%SDS（65 ℃預(yù)熱），65 ℃水浴40 min，每10 min上下顛倒混勻1 次。水浴后加入100 μL KAc 冰浴30 min后加入500 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）搖晃混勻12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于新離心管中加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）12 000 r·min-1離心10 min。取上清液于新離心管中加入等體積異丙醇（預(yù)冷）-20 ℃冷凍45 min，12 000 r·min-1離心10 min 棄上清液留下底部DNA 沉淀，70%無水乙醇洗滌沉淀兩次，室溫條件下風(fēng)干10 min，加50 μL TE 緩沖液和2 μL RNaseA 37 ℃水浴10 min 后迅速放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 試劑盒法

真菌DNA 試劑盒提取使用康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA 提取試劑盒（目錄號CW0531S），提取步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2.4 改良脲素法

參照李競生方法，略改進(jìn)[7]。0.1 g菌絲在研缽中用液氮研磨至粉末狀，加入1 mL 脲素裂解緩沖液（65 ℃預(yù)熱），上下顛倒混勻，使菌絲細(xì)胞充分裂解。12 000 r·min-1離心5 min，取上清液700 μL于新離心管中加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）搖晃混勻。12 000 r·min-1離心5 min后取上清液500 μL 加入等體積異丙醇（預(yù)冷）和1/10 體積的NaAc（預(yù)冷）-20 ℃冷凍沉淀DNA 45 min。12 000 r·min-1離心10 min 后棄上清液留下DNA 沉淀，70%無水乙醇洗滌沉淀2 次，室溫條件下風(fēng)干10 min，加50 μL TE緩沖液和2 μL RNaseA，37 ℃水浴10 min后迅速放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5 改良ROSE法

參照Steiner 等方法并增加兩步操作形成“改良ROSE法”[8]。0.1 g菌絲液氮速凍磨碎后加入500 μL ROSE 裂解緩沖液（預(yù)熱）搖晃混勻，90 ℃溫浴20 min后置于冰上10 min。12 000 r·min-1離心10 min取上清液于新離心管中加入等體積異丙醇（預(yù)冷）和1/10體積NaAc（預(yù)冷）-20 ℃放置30 min。取出后12 000 r·min-1離心10 min，棄上清留下底部DNA沉淀用70%無水乙醇洗滌沉淀兩次，室溫下風(fēng)干10 min，加50 μL TE緩沖液和2 μL RNaseA，37 ℃水浴10 min，迅速放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紫外光分光光度計(jì)檢測

取不同方法提取的DNA 樣品及TE 緩沖液（空白對照）各1 μL 利用核酸蛋白分析儀NanoDrop 2000 檢測稻曲病菌DNA 樣品OD260/OD280及OD260/OD230波長處紫外吸收比值、濃度并計(jì)算得率。

1.2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

取4 μL稻曲病菌DNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.5 PCR檢測

PCR 擴(kuò)增引物為稻曲病菌特異性引物[11]：US1-5（5' CCG GAG GAT ACA ACC AAA AAA ACT CT 3'）和US3-3（5'GCT CCA AGT GCG AGG ATA ACT GAA T 3'）。目的產(chǎn)物片段長度380 bp。

PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，ddH2O 7.4 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，總體系20 μL。

PCR反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取4 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像。

1.2.6 Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)

反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶1 μL，稻曲病菌DNA 樣品1 μL，加入ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。37 ℃水浴1 h，酶切反應(yīng)結(jié)束后取4 μL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取步驟、成本、毒性、耗時(shí)比較

不同DNA提取方法比較結(jié)果見表1。

由試驗(yàn)結(jié)果可見，在提取步驟上，CTAB 法和SDS法需多次震蕩加熱，操作過程較為劇烈，易造成DNA 斷裂及降解，而改良ROSE 法操作簡單快捷，不需抽提、水浴、震蕩等復(fù)雜步驟。在試驗(yàn)成本上，試劑盒價(jià)格昂貴，提取大量DNA 樣本作分子標(biāo)記及遺傳圖譜建立等分子生物試驗(yàn)時(shí)，成本較高，改良ROSE法僅需通過配制簡單化學(xué)試劑即可提取大量樣本。在毒性方面，CTAB 法、SDS法、改良脲素法需利用苯酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑抽提，釋放大量有毒氣體。改良ROSE法無需有機(jī)試劑抽提，環(huán)保無毒。在耗時(shí)方面，傳統(tǒng)CTAB 法、SDS 法 提 取DNA 時(shí) 長 達(dá)3.5 h，改 良ROSE 法僅需1.5 h 便可快速提取DNA。綜上所述，改良ROSE 法較其他提取方法具有操作簡便快速、成本低、環(huán)保無毒、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)勢。

表1 5種方法提取步驟、成本、毒性、耗時(shí)比較結(jié)果Table 1 Comparison results of extraction procedure,cost,toxicity and time consumption of five methods

2.2 不同方法提取DNA質(zhì)量比較

檢測指標(biāo)OD260、OD280、OD230分別表示核酸、蛋白質(zhì)、糖類多酚等雜質(zhì)吸光度。高純度DNA OD260/OD280約為1.8，當(dāng)OD260/OD280>1.9 時(shí)，表明有RNA 污染，OD260/OD280＜1.6 時(shí)，表明有蛋白質(zhì)污染。高純度DNA OD260/OD230<2.0，當(dāng)OD260/OD230>2.0時(shí)，表明DNA有多糖、酚類物質(zhì)污染。利用核酸蛋白分析儀NanoDrop 2000 檢測稻曲病菌DNA 樣品OD260/OD280及OD260/OD230波長處紫外吸收比值，并根據(jù)DNA 檢測濃度計(jì)算5 種方法DNA 得率（見表2）。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，CTAB法、試劑盒法和改良ROSE 法提取得到的稻曲病菌基因組DNA OD260/OD280≈1.8，且OD260/OD230>2.0，表明3 種方法可提取高質(zhì)量稻曲病菌DNA。而SDS 法和改良脲素法提取到的稻曲病菌基因組DNA OD260/OD280≤1.6，OD260/OD230<2.0，表明DNA 存在輕微蛋白質(zhì)和多糖及酚類物質(zhì)污染。在稻曲病菌基因組DNA 純度上，改良ROSE法可得到高純度DNA，與傳統(tǒng)CTAB法稻曲病菌DNA純度相當(dāng)，且優(yōu)于其余4種方法稻曲病菌DNA 純度。在稻曲病菌基因組DNA 得率上，CTAB 法DNA 得率最大為446.28 μg·g-1，其次改良ROSE法為360.35 μg·g-1。而試劑盒和改良脲素法DNA 得率較低，分別為155.80 和200.26 μg·g-1。改良ROSE法DNA得率僅次于CTAB法，且顯著高于改良脲素法和試劑盒法，表明該方法可高效提取稻曲病菌基因組DNA。

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

5種方法提取的稻曲病菌DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。

表2 5種方法提取的DNA質(zhì)量結(jié)果比較Table 2 Comparison results of total DNA isolated by five methods

圖1 5種方法提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 Test results of agarose gel electrophoresis detection of genomic DNA obtained by five methods

由圖1 可見，CTAB 法和SDS 法提取的DNA 條帶清晰明亮但存在條帶拖尾現(xiàn)象，說明DNA 輕度降解。SDS 法和改良脲素法提取DNA 點(diǎn)樣孔不同程度發(fā)亮，表明提取的DNA 有較多蛋白質(zhì)、多糖及其他次生代謝產(chǎn)物污染，其中SDS 法提取得到的DNA 污染最為嚴(yán)重，與紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果一致。改良脲素提取法和試劑盒提取的DNA 條帶較弱，可見這兩種提取方法稻曲病菌DNA 得率低。改良ROSE 法提取的DNA 條帶單一明亮，無拖帶現(xiàn)象，且點(diǎn)樣孔無發(fā)亮現(xiàn)象。綜合紫外分光光度計(jì)對DNA 質(zhì)量的定量檢測與瓊脂糖凝膠電泳對DNA 的定性檢測，5 種方法中改良ROSE法提取稻曲病菌基因組DNA 的純度最高、質(zhì)量最好。

2.4 PCR檢測

稻曲病菌特異性引物US1-5/US3-3對5種DNA提取方法得到的稻曲病菌基因組DNA 作PCR 特異性擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2?？梢?，5 種方法提取得到的稻曲病菌DNA 均擴(kuò)增得到稻曲病菌380 bp 特異性條帶，且整齊單一，無非特異性條帶。除試劑盒和改良脲素法提取得到的DNA PCR 擴(kuò)增特異性條帶較弱，其余3 種方法提取得到DNA PCR 擴(kuò)增條帶均明亮整齊。SDS和CTAB法提取到的DNA中蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)也未對其DNA PCR 特異性擴(kuò)增產(chǎn)生影響。綜上所述，改良ROSE法與其他4種DNA 方法提取得到的稻曲病菌基因組DNA 均可穩(wěn)定PCR擴(kuò)增，且PCR產(chǎn)物特異性好，重復(fù)性高。

A-CTAB法；B-SDS法；C-試劑盒法；D-改良脲素法；E-改良ROSE法；M-DNA marker DL2000；CK-空白對照；1-水稻稻曲病菌（U.virens UV-WC-1）；2-水稻稻曲病菌（U.virens UV-AC-1）；3-水稻稻曲病菌（U.virens UV-FZ-1）A-CTAB method；B-SDS method；C-DNA extraction kit；D-Modified urea method；E-Modified ROSE method；M-DNA marker DL2000；CK-Blank control；1-U.virens(Strain UV-WC-1)；2-U.virens(Strain UV-AC-1)；3-U.virens(Strain UV-FZ-1)

2.5 Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切檢測

DNA樣品中如存在大量蛋白質(zhì)、多糖及其他次生代謝產(chǎn)物將嚴(yán)重影響限制性內(nèi)切酶酶切效率[12]。Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶對5 種方法提取得到的DNA酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。

圖3 5種方法提取的DNA限制性內(nèi)切酶消化結(jié)果Fig.3 Test results of Eco RⅠrestriction endonuclease enzyme digestion of genomic DNA obtained by five methods

由圖3 可見，CTAB 法和SDS 法提取得到的DNA 酶切產(chǎn)物均可見大面積彌散狀條帶，但SDS法提取的DNA 未被完全消化，存在明顯DNA 殘留，表明酶切效率受殘留蛋白質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物的影響。改良脲素法和試劑盒提取得到的DNA 酶切產(chǎn)物彌散狀條帶較弱，可能被限制性內(nèi)切酶過度消化。改良ROSE 法提取的DNA 酶切效果最好，酶切產(chǎn)物電泳后呈明亮大面積彌散條帶，表明該方法提取的DNA 中無蛋白質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物及化學(xué)試劑等物質(zhì)影響酶活性，稻曲病菌DNA 可用于高效酶切。

3 討論與結(jié)論

稻曲病菌培養(yǎng)過程中菌絲生長特點(diǎn)為①平板培養(yǎng)菌絲生長緩慢、收集周期長；②液體震蕩培養(yǎng)菌絲產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物，菌絲體呈黃色粘稠狀。因此，快速高效獲取高質(zhì)量稻曲病菌DNA 存在難度。

伏榮桃等采用SDS、CTAB、試劑盒3 種方法對比稻曲病菌DNA 提取效果，CTAB 法是提取稻曲病菌基因組DNA 的最優(yōu)方法，與本試驗(yàn)結(jié)果相似[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，CTAB 法可提取高質(zhì)量DNA 且優(yōu)于SDS 法、改良脲素法和試劑盒法。但CTAB法操作過于繁瑣，易造成DNA鏈斷裂，需接觸氯仿、苯酚等有毒試劑，提取時(shí)間長達(dá)3.5 h，耗時(shí)費(fèi)力。傳統(tǒng)ROSE 法步驟簡單快速高效，但DNA 純度與得率相對較低，僅適用于大量DNA 樣品粗略定性分析研究，如注重高通量、快速低成本提取DNA 的稻曲病菌群體遺傳多樣性分子研究，不適用于基因克隆、QTL 定位等對DNA 質(zhì)量與濃度有較高要求的分子試驗(yàn)[14]。

“改良ROSE 法”在原有ROSE 法操作步驟上增加兩個(gè)步驟提高DNA 提取純度與得率。①加入預(yù)冷異丙醇和NaAc-20 ℃放置30 min，充分沉淀提取液中DNA，提高稻曲病菌DNA 得率。②70%無水乙醇漂洗沉淀以去除DNA 中殘余的鹽離子，提高DNA純度。相比傳統(tǒng)ROSE法，“改良ROSE法”提取的DNA純度與得率均大幅提高，與CTAB法提取得到的DNA 質(zhì)量相當(dāng)且保留原有ROSE 法高通量、快速、低成本優(yōu)勢。

“改良ROSE法”成功用于稻曲病菌基因組DNA提取，可簡單、快速獲得高質(zhì)量稻曲病菌基因組DNA。該方法提取的稻曲病菌DNA 可滿足稻曲病菌分子標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建等需短時(shí)獲取大量DNA 樣本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求，也適用于基因精細(xì)定位、構(gòu)建基因組文庫等需高質(zhì)量DNA 樣本的分子生物學(xué)研究。不同生物材料適用于不同DNA提取方法，冉策等通過比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTAB法能提取到高質(zhì)量草莓DNA 用于PCR 技術(shù)檢測草莓鑲脈病毒[15]。賀羽等研究報(bào)道，對于蘋果球殼孢腐爛病菌CTAB 法提取的DNA 效果優(yōu)于試劑盒提取法[16]?！案牧糝OSE 法”是否同樣適用于其他生物材料DNA提取尚待進(jìn)一步研究。