廖紫玉，弘子姍，黃艾祥，龔加順，譚超

（云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

咖啡以其獨特的風味受到人們的喜愛。綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、咖啡因（caffeine，CAF）、葫蘆巴堿（trigonelline，TRI）是咖啡中重要的物質，影響著咖啡的風味變化。CGA是由奎寧酸與肉桂酸鹽類合成的，屬多酚類化合物，占咖啡物質組成的6%～12%[1]，是咖啡中獨特的成分之一[2]，影響著咖啡的苦澀味。CGA在烘焙中經Strecker降解反應分解為咖啡酸、阿魏酸與奎尼酸，間接影響咖啡最終的酸度，并賦予咖啡收斂性和苦味[3]。CAF是一種黃嘌呤生物堿化合物，也是咖啡中重要的風味物質[4]，呈苦味，影響咖啡的醇厚感和苦澀度[3]。TRG為尼克酸甲基化的產物，是植物體內的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADP）代謝或轉化產物，決定著咖啡的澀味，并兼具提神功效[5]。

三維熒光法是將熒光強度表示為激發(fā)波長-發(fā)射波長兩個變量的函數，即三維熒光光譜（three-dimensional excitation-emission matrix，3D-EEM），它能夠表示激發(fā)波長（excitation wavelength，λex）和發(fā)射波長（emission wavelength，λem）同時變化時的熒光強度信息[6]，物質不同，特征熒光譜也不同。3D-EEM具有良好的選擇性和高靈敏度，檢測方法也較為簡捷、所需樣品少、復現性好，這些優(yōu)點使得其在食品檢測和生物檢測中得到廣泛的應用[7]。目前，對咖啡中成分的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8-11]、毛細管電泳電化學檢測法[12-13]、高效液相色譜-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[14-16]和分光光度法[17]等，但這些方法樣品的前處理較為復雜繁瑣，近年來利用3D-EEM在牛肉新鮮度評價[18]、獸藥殘留檢測[19]、水體污染物的檢測[20-21]、藥物研究[22]已有較多報道，而利用3D-EEM針對咖啡成分的研究還較少。

本文基于3D-EEM對不同品種生咖啡、烘焙咖啡浸提液熒光光譜進行研究，針對特征成分CGA、CAF、TRG建立3D-EEM圖譜特征數據，結合特征圖譜探究其半定量可行性，為咖啡豆品種的快速鑒別以及咖啡豆中CGA、CAF、TRG含量快速測定提供一定理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

5種不同品種咖啡豆（2016產季）：廣州伊蘊麗貿易有限公司；CGA標準品、TRG標準品：上海源葉生物科技有限公司；CAF標準品：成都德銳可生物科技有限公司。

F97Pro型熒光分光光度計：上海棱光技術有限公司；興盛多功能高速粉碎機：永康市兆申電器有限公司；SANTOKER R500E烘焙機：三豆客咖啡科技；Coffee Roast Analyzer RA-710烘焙度測試儀：Acronova Technolog。

咖啡豆樣品見表1。

表1 咖啡豆樣品Table 1 Sample of coffee beans

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品及標準品制備

咖啡生豆、烘焙豆粉碎后用UP水制備為濃度為2.5 mg/mL的溶液備用。各配制濃度為0.5 mg/mL的4種 CGA、CAF、TRG、CGA-CAF-TRG（體積比 1 ∶1 ∶1）混合溶液備用。

1.2.2 咖啡豆烘焙

咖啡生豆采用SANTOKER R500E烘焙機烘焙?；鹆?0.5 kPa，風門 4，轉速 60 r/min。每次入豆 250 g。烘培失水率范圍控制在13.47%～15.14%。烘培程度范圍在56.7～73.3基本上在65左右，接近于中、深度烘培。

1.2.3 CGA、CAF、TRG三維熒光二維熒光指紋圖譜及測定線性濃度范圍的建立

1）CGA、CAF、TRG三維熒光分析條件設置：發(fā)射波長 λem=200 nm～900 nm，激發(fā)波長 λex=200 nm～900 nm，每隔10 nm激發(fā)掃描一次，掃描速度為30 000 nm/min，激發(fā)寬帶、發(fā)射寬帶為10 nm，光電倍增管增益（photomultiplier tube，PMT）=900 V高，相應時間自動匹配。按照CGA、CAF、TRG三維熒光分析條件設置分別對制備好的CGA、CAF、TRG標準溶液和 CGA、CAF、TRG混合標準溶液進行三維熒光掃描，建立CGA、CAF、TRG的三維熒光指紋圖譜。以相同方法做純凈水空白對照組。

2）CGA、CAF、TRG的二維熒光分析條件設置（激發(fā)模式）：測量類型為波長掃描，掃描模式為激發(fā)模式，數據模式為熒光模式，λem分別為：CGA 457 nm；CAF 681nm；TRG 380 nm。λex起始波長分別為：CGA 320 nm；CAF 360 nm；TRG 280 nm。λex終止波長分別為：CGA 420 nm；CAF 480 nm；TRG 360 nm。掃描速度均為300 nm/min，等待時間均為0 s，激發(fā)帶寬均為10 nm，發(fā)射帶寬均為 10 nm，增益（PMT）均為15檔（900 V），響應時間自動匹配，自動光門未使用，重復次數為一次，重復間隔為0 s。

1.3 數據處理

采用F97Pro型熒光分光光度計連接電腦自帶軟件進行數據統(tǒng)計和處理，做3次平行。

2 結果與分析

2.1 對照、標準品及混標的3D-EEM光譜特征

圖1為對照、標準品及混標的3D-EEM光譜特征圖。

圖1 對照、標準品及混標的3D-EEM光譜特征Fig.1 3D-EEM spectral characteristics of reference standard and mixed standard

考慮到咖啡液體以水為溶劑，因此選擇超純水作空白對照組，圖中從原點起始的斜線部分主要有瑞利散射（rayleigh scattering）、拉曼散射（raman scattering）和倍頻峰線。在瑞利散射中，入射光與物質分子沒有發(fā)生能量交換，它的波長和激發(fā)波長相同，強度是入射光強度的10-3倍；拉曼散射是由于處在激發(fā)態(tài)的分子沒有躍遷至基態(tài)而偏離原來的能級，到達稍高或稍低能級產生的，強度是入射光強度的10-6～10-8。拉曼散射、瑞利散射與水中粒子的濃度和體積有關。倍頻峰是由光柵衍射造成的。這4條峰線均屬干擾散射，除此以外可以看出熒光光譜純凈，無雜質干擾。各添加0.5 mg/mL CGA、CAF、TRG標準品均能出現特征熒光峰。CGA主要位于λex/λem=（340～400）nm（/390～600）nm，λex=371.0 nm，λem=457.0 nm處熒光信號最強。CAF主要出現兩個峰分別位于λex/λem=（363～456）nm（/640～750）nm和λex/λem=（460～527）nm（/508～586）nm，在λex=411.0 nm，λem=681.0 nm 和 λex=499.0 nm，λem=538.0 nm處熒光信號最強。TRG主要位于λex/λem=（280～410）nm/（345～550）nm，λex=330.0 nm，λem=380.0 nm 處熒光信號最強?；旌蠞舛葹?.5 mg/mL的CGA、CAF、TRG 3種標準液后，熒光峰發(fā)生了變化，僅出現一個峰，主要位于λex/λem=（357～410）nm（/390～595）nm，λex=380.0 nm，λem=457.0 nm處熒光信號最強。熒光特征峰范圍非常接近CGA峰范圍。

從3種標準液的熒光強度上看，在相同濃度條件下CGA、CAF、TRG的激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光強度都不同。熒光強度：TRG＞CGA＞CAF。TRG在λex=330.0 nm，λem=380.0 nm處相對熒光強度為1 036.00，CGA在λex=371.0 nm，λem=457.0 nm處相對熒光強度為 852.20，CAF在易辨的λex=411.0 nm，λem=681.0 nm處相對熒光強度為74.32。

2.2 不同品種生咖啡、烘焙咖啡浸提液3D-EEM光譜特征

一些親水性有機酸、核酸、氨基酸、碳水化合物、表面活性劑等，這些污染物分子結構大多具有共軛雙鍵芳香烴或雙鍵、羰基、羧基等共軛體系，在紫外光區(qū)受到特定波長光線的激發(fā)照射時會發(fā)射不同波長的熒光，咖啡中也含有類似成分。

5種不同品種生熟咖啡豆樣品三維熒光差異對比圖見圖2。

由圖2可知，不同品種生咖啡浸提液熒光峰較為散亂，主要熒光峰分布在兩塊，峰值最高的熒光峰在λex/λem=（359～450）nm（/365～761）nm范圍，另一塊峰值較低為λex/λem=（750～860）nm（/450～560）nm范圍。咖啡烘焙后浸提液熒光峰與生咖啡浸提液熒光峰范圍明顯發(fā)生變化，熒光峰集中為一塊在λex/λem=（380～600）nm。

圖2 5種不同品種生熟咖啡豆樣品三維熒光差異對比圖Fig.2 Three-dimensional fluorescence difference comparison of 5 different varieties of cooked coffee beans

官能團的含量增加或減少，或發(fā)生物質氧化作用時，即相應地表現出熒光峰的紅移或藍移。咖啡烘焙后的浸提液中熒光峰最高點從λex=401 nm，λem=480 nm，向λex=480 nm，λem=550 nm紅移，與咖啡豆中含有羥基、羰基、羧基等熒光基團數量的多少有關。

生咖啡浸提液的熒光峰分布松散，烘焙咖啡浸提液熒光分布緊密，黃微[24]的研究表明，3D-EEM等高線的疏密程度反映了投影圖中熒光峰的陡峭程度?？Х群姹汉笃涞雀呷γ娣e增大，熒光峰強度值變小。最高λex發(fā)生紅移，熒光峰最大值衰減，推測是由于咖啡中的CGA、TRG等物質分解及其他咖啡中化合物轉化有關。烘焙咖啡與生咖啡浸提液相比熒光峰偏移的大小不同。

結合文獻，熒光指紋圖和熒光位移表來看，3DEEM可以明顯區(qū)分咖啡生豆浸提液和烘焙咖啡浸提液，但由于咖啡成分的復雜性，在區(qū)分咖啡品種方面較為困難。不同品種咖啡豆樣品最高峰峰值及主熒光峰位移見表2。

表2 不同品種咖啡豆樣品最高峰峰值及主熒光峰位移Table 2 Maximum peak-to-peak value and main fluorescence peak displacement table of 5 different species of coffee beans

2.3 利用3D-EEM對咖啡浸提液中CGA、CAF、TRG定量初探

不同品種生熟咖啡豆樣品中CGA、CAF、TRG差異性對比見表3。

結合3D-EEM數據分析，發(fā)現所有咖啡在烘焙后的浸提液中CGA、CAF、TRG熒光值均有下降，通過公式計算，化合物相對含量=該化合物在咖啡液中特征熒光位置峰值/標準品特征熒光峰值×標準品濃度，得出該化合物的相對含量?？梢钥闯霾煌贩N咖啡生豆CGA含量為0.69%～1.38%，烘焙后下降為0.06%～0.11%；咖啡生豆CAF含量為4.12%～8.37%，烘焙后下降為1.71%～2.35%；咖啡生豆TRG含量為0.08%～0.10%，烘焙后下降為0.04%～0.08%。由于CAF在3DEEM中含有兩個峰，在計算中只以主峰計算相對含量，因此存在結果偏低可能。除此以外，3D-EEM含量分析結果與邵金良等[25]研究結果接近。邵金良等研究表明咖啡及咖啡制品CGA含量為0.32%～6.24%，生咖啡豆＞焙炒咖啡豆；CAF含量1.10%～4.62%，焙炒咖啡豆＞生咖啡豆；TRG含量為0.09%～1.41%，生咖啡豆＞焙炒咖啡豆。CGA和CAF為第1主成分貢獻率64.932%，TRG為第2主成分貢獻率34.944%。3DEEM對咖啡中化合物定量的數據變化趨勢也符合蔡瑞玲[26]、呂文佳[1]與Casal[27]等的研究表明，CGA在咖啡烘焙中，受熱分解酯鍵斷裂，生成奎寧酸及阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸等物質；TRG受熱分解形成大量CO2及風味物質，因此，CGA和TRG在咖啡烘焙后含量均會下降。由于CAF熱穩(wěn)定性比較強，烘焙對其含量影響不大，但由于烘焙過程中水分喪失，會導致烘焙咖啡中CAF的相對含量高于咖啡生豆。

表3 不同品種生熟咖啡豆樣品中CGA、CAF、TRG差異性對比Table 3 Differences of CGA，CAF and TRG in 5 different varieties of cooked coffee beans

目前，尚無利用3D-EEM測定咖啡中CGA、CAF、TRG的報道，利用3D-EEM對標準品進行指紋圖譜建立，利用化合物特征熒光光譜定量，也存在一些問題。1）該技術對所檢測的物質有一定限制，檢測過程中必須能夠捕捉到熒光信息；2）熒光強度會受到環(huán)境因素的影響；3）熒光會受到溶液介質中微小粒子或分子的影響而產生散射峰（主要是瑞利散射和拉曼散射）[28]。作為初探本文并未采用加權法、德勞內三角形內插值法、平行因子等方法[29]進行去瑞利散射和拉曼散射，此外在定量方面也未進行加樣回收率測試，未來尚需進一步研究。

3 結論

本文初探了不同品種生咖啡、烘焙咖啡浸提液中CGA、CAF、TRG的 3D-EEM分析方法。發(fā)現 CGA、CAF、TRG均有特征熒光峰，不同品種生咖啡、烘焙咖啡浸提液的3D-EEM圖譜具有差異性。生咖啡浸提液在發(fā)射波長為365 nm～761 nm范圍內會出現特征熒光峰，且熒光峰有各自的特點，易于區(qū)分?？Х群姹汉蟮慕嵋簾晒馓卣髯罡叻宓募ぐl(fā)波長、發(fā)射波長向高波長區(qū)段移動，發(fā)生了熒光峰紅移現象，不同品種烘焙咖啡浸提液熒光峰位移大小有差異。利用3D-EEM結合特征峰強度計算烘焙前后咖啡浸提液中3種特征成分含量，可知CGA、CAF、TRG在烘焙后含量均有下降。因此，3D-EEM可對不同地區(qū)咖啡豆浸提液中CGA、CAF、TRG含量進行初步分析，可以明顯區(qū)分咖啡生豆浸提液和烘焙咖啡浸提液，但由于咖啡成分的復雜性，在區(qū)分咖啡品種方面較為困難。