張夢丹，王浪，李偉，宋文丹，肖袁俊，陶帆，倪偉，胡圣偉

（石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000）

隨著人們飲食結構的改變，糖尿病患病率在逐漸上升，對我國人民健康的影響日趨嚴重，因此尋找方便可靠、安全綠色的方法來治療糖尿病顯得尤為重要[1]。駱駝奶是治療慢性疾病一種食品[2]，它的成分包括免疫調節(jié)蛋白、脂肪酸、重要礦物質、維生素和外泌體等，它具有抵抗炎癥、保護肝臟和心臟、降低血糖等作用[3-7]。外泌體（exosome）由不同來源的細胞產生，是天然存在于人乳、牛乳等各種乳源液體的一種分泌小體，直徑為30 nm～150 nm的膜狀納米囊泡[8-9]，能夠通過多種方式產生相互作用，如將受體與配體結合，進行胞吞作用等[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有重要的生物學作用，可以作為檢測和診斷疾病的生物標志物[12]，同時也可以作為細胞間交流的特殊媒介[13-15]。

本試驗通過超高速離心的方法分離了駱駝奶中的外泌體，通過電鏡和反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 法鑒定提取的外泌體。利用高糖高脂飼料加鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導普通小鼠為糖尿病模型小鼠，灌胃外泌體溶液，對試驗小鼠血糖和體重進行測量，初步探討駱駝奶中外泌體降糖效果，為進一步研究外泌體的效果奠定基礎，也為糖尿病的新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5周～6周齡的雌性C57BL/6J小鼠：石河子大學；普通飼料、高脂高糖飼料：達爾文生物有限公司；小鼠均在25℃的動物室中分籠飼養(yǎng)，并保持自然光照，并自由攝入食物和水。

1.2 主要試劑與儀器

駱駝奶（泌乳期為6個月）：新疆天山牧場；鹽酸二甲雙胍緩釋片（批號H20060815）：山西華元醫(yī)藥生物技術有限公司；鏈脲佐菌素（批號WXBC8740V）：美國SIGMA公司；蛋白定量試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司；聚合酶鏈式反應（PCR）引物：北京睿博興科生物技術有限公司合成；Trizol試劑、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）等：生工生物工程上海有限公司。

Accu-Chek Active羅氏活力血糖儀及血糖試紙：羅氏血糖健康醫(yī)護公司；Beckman Optima XPN-100 Ultracentrifuge智能型高效離心機：貝克曼庫爾特有限公司；精密電子天平：常州市衡正電子儀器有限公司；Varioskan LUX酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 駱駝奶中外泌體的制備

收集駱駝奶樣品40 mL～50 mL。參照Marika等的方法[16]，使用超高速離心法獲得外泌體，具體步驟：將新鮮的駱駝奶樣品在4℃下于2 000 g離心20 min，收集乳上清；將收集的乳上清在4℃下以12 000 g離心30 min，收集上清；重復一次上步驟。將40 mL的脫脂乳上清液在4℃以110 000 g離心60 min以獲得上清乳漿。再將收集的乳上清放入4℃以110 000 g離心2 h收集沉淀，獲得外泌體。將沉淀外泌體懸浮在PBS緩沖液中，得到的外泌體溶液放入-20℃冰箱保存，待用。

1.4 外泌體的鑒定

使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察了駱駝奶中外泌體的形態(tài)和粒徑大小。將10 μL外泌體懸浮液裝載在無定形碳包覆銅網(wǎng)上。通過加入10 μL中性的1%磷鎢酸進行負染。然后通過在80 kV加速電壓下運行的TEM檢查網(wǎng)格中的外泌體。參照Yassin等的方法[17]，使用RT-PCR的方法鑒定所提取的外泌體，將收集的外泌體使用Trizol法提取外泌體總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，GAPDH基因作為參考基因，α酪蛋白基因（α Casein）、β酪蛋白基因（β Casein）和 κ酪蛋白基因（κ Casein）作為標志基因，詳細引物序列見表1。

表1 標志基因引物序列Table 1 Marker gene primer sequences

1.5 T1DM模型小鼠的構建

在注射藥品之前，將小鼠禁食12 h。使用時將STZ溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中，并以70 mg/kg腹腔內給藥，每隔3 d測血糖，直至模型組血糖顯示值大于11.1 mmol/L后，重新喂食普通飼料，兩周后檢測血糖，檢測糖尿病小鼠血糖的穩(wěn)定性，Ⅰ型糖尿病小鼠制備完成。

1.6 動物分組及給藥方案

將C57BL/6J小鼠分為兩組，健康組（對照組）和糖尿病模型小鼠組。將糖尿病模型小鼠隨機分為3組：外泌體組、鹽酸二甲雙胍緩釋片組、模型對照組，分組標記。

將所有的藥物（包括生理鹽水、外泌體溶液、鹽酸二甲雙胍緩釋片溶液），均通過每日定時灌胃給各組的方式觀察效果。對照組每天灌胃0.02 mL/g生理鹽水，外泌體組每天灌胃5 mg/kg制備好的外泌體，鹽酸二甲雙胍緩釋片組每天灌胃由生理鹽水配制的250 mg/kg鹽酸二甲雙胍緩釋片溶液，模型對照組每天灌胃0.02 mL/g生理鹽水。

1.7 血糖及體重的檢測

成功造模型后在第 0、10、20、30、40 d 測量血漿葡萄糖的濃度和小鼠體重。使用血糖測試儀分別對禁食6 h的小鼠尾靜脈收集血液測血糖濃度。使用電子稱測量小鼠體重，記錄。

1.8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件進行處理分析，n=10，各組數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 駱駝奶中外泌體的形態(tài)鑒定

使用傳統(tǒng)超速離心法提取的駱駝奶中外泌體在透射電子顯微鏡下可以觀察到結構完整，直徑小于100 nm，清晰的圓形的囊泡見圖1，借助傳統(tǒng)的超高速離心法成功獲得完整的外泌體。

圖1 透射電子顯微鏡下觀察外泌體Fig.1 Exosomes observed under a transmission electron microscope

2.2 駱駝奶中外泌體標志基因的鑒定

使用RT-PCR法鑒定外泌體中標志基因。經過RT-PCR擴增后，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示標志基因都正常表達且大小正確見圖2。

2.3 小鼠形態(tài)特征觀察

健康對照組小鼠生長及飲食狀況正常，被毛有光澤。模型對照組小鼠出現(xiàn)多飲多食多尿現(xiàn)象，體重也明顯減輕，具有糖尿病的典型癥狀。用外泌體和二甲雙胍灌胃處理后，以上癥狀得到明顯改善。

2.4 外泌體對T1DM小鼠血糖的影響

各組小鼠空腹血糖的變化見表2。

圖2 外泌體內標志基因的鑒定Fig.2 Identification of marker genes in exosomes

表2 各組小鼠空腹血糖的變化（±s）Table 2 Changes in fasting blood glucose of mice in each group（xˉ±s）

表2 各組小鼠空腹血糖的變化（±s）Table 2 Changes in fasting blood glucose of mice in each group（xˉ±s）

注：##表示與健康對照組相比差異極顯著（P<0.01）；*表示與模型對照組相比差異顯著（P<0.05）；**表示與模型對照組相比差異極顯著（P<0.01）。

組別血糖濃度/（mol/L）0 d 10 d 20 d 30 d 40 d健康對照組 7.25±0.48** 6.95±0.79** 7.3±1.04** 7.55±0.79** 7±0.86**外泌體組 23.22±7.89## 21.22±8.45 18.02±7.92* 17.7±8.45* 13.25±2.41**雙胍藥物組 22.2±8.52## 22.07±9.82# 19.32±10.05* 15.775±8.34* 10.6±8.69**模型對照組 23.6±5.06## 22.95±2.34## 24.1±2.58## 27.725±3.03## 29.5±2.56##

表2記錄了0～40 d不同組的小鼠血糖濃度，結果表明，健康對照組的血糖濃度都是穩(wěn)定在正常范圍，模型對照組的血糖持續(xù)在高濃度，其中部分小鼠因血糖濃度過高死亡，這表明模型建造穩(wěn)定。外泌體組和藥物組與模型組比較小鼠的血糖發(fā)生明顯的變化，在連續(xù)灌胃20 d后，血糖含量開始顯著下降（P<0.05），直至灌胃結束，這兩組與模型對照組的血糖相比表現(xiàn)為極顯著差異（P<0.01）。外泌體與二甲雙胍藥物效果相比，效果相似，對小鼠高血糖具有明顯的降低和控制作用，可見試驗可以近一步研究外泌體的劑量，選取合適的濃度，更好的治療糖尿病。

2.5 外泌體對T1DM小鼠體重的影響

各組小鼠空腹體重的變化見表3。

表3 各組小鼠空腹體重的變化Table 3 Changes in fasting weight of mice in each group

通過表3顯示，直至灌胃結束后各組體重都發(fā)生了一定的變化。健康對照組的小鼠隨著時間的變化，體重都在正常增加，模型對照組小鼠的體重，隨著時間的變化，體重一直在降低，這屬于糖尿病臨床癥狀。而外泌體和二甲雙胍組小鼠的體重都是先降低隨后又小幅度升高，是隨著血糖的變化，體重也相應發(fā)生了變化，灌胃結束后，體重接近健康對照組。

3 討論與結論

糖尿病的主要臨床表現(xiàn)是血糖濃度高，目前降糖藥主要分為：胰島素及其類似物、磺酰脲類促泌劑、二甲雙胍類等，這些降糖藥因具有見效快，作用久的優(yōu)點在臨床上獲得了廣泛的應用，但長期使用會讓患者有其他的并發(fā)癥。駱駝奶作為重要的經濟農產品，很多研究表明它能夠預防以及治療糖尿病，能有效控制血糖含量并且保護腎臟和肝臟[18]，但其作用機制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織巨噬細胞衍生的外泌體中攜帶的microRNA可以調節(jié)體內和體外胰島素敏感性[19]，這使研究者認為駱駝奶中的外泌體可能是駱駝奶治療糖尿病的有效成分之一，并且可能是外泌體中含有的microRNA具有調節(jié)細胞分泌胰島素的作用。已有相關研究表明口服外泌體給藥方式具有一定免疫耐受性[20]，同時也有相關研究表明外泌體在糖尿病心肌損傷的防治方面起重要作用[21]，這為試驗的可行性提供了依據(jù)。

本研究通過超速離心法分離鑒定了駱駝奶中的外泌體，對糖尿病小鼠進行40 d的灌胃處理，證明駱駝奶中外泌體能夠降低STZ誘發(fā)的糖尿病的血糖濃度，起到治療糖尿病的效果，而本試驗的研究只是初步探究外泌體對糖尿病的治療效果，后續(xù)應繼續(xù)進行定量的研究，并且研究其作用途徑以及機制，如外泌體中microRNA對糖尿病治療所發(fā)揮的作用。