李霞，郝思嘉，韓愛玲，楊亞瑜，方國臻，劉繼鋒，*，王碩 ,2，*

（1.天津科技大學食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫(yī)學院，天津300071）

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs），是一類人工合成的有機化合物，作為一種增塑劑，廣泛應用于食品包裝材料的生產(chǎn)和加工中[1]。PAEs與聚合物基質(zhì)的結(jié)合方式主要通過物理結(jié)合，而非化學共價鍵結(jié)合，因此在PAEs使用及處理過程中很容易以直接或間接方式從包裝材料中滲漏到食品中，從而導致食品安全問題[1-2]。據(jù)統(tǒng)計人類通過食物、飲用水以及接觸包裝材料PAEs的每日攝取量可高達70 μg/kg[2-3]。此外，一些PAEs被認為是誘變劑、致癌物、肝毒素，即使在低濃度條件下也可能對人類健康造成威脅，例如損害人類的生殖健康和生長發(fā)育[1，4]。因此，如何有效控制PAEs日益引起人們的重視，美國環(huán)境保護局（United States Environmental Protection Agency，US EPA）和歐盟已經(jīng)將6種PAEs列入優(yōu)先控制污染物名單中。

目前報道了很多方法用來降低PAEs的污染，包括微生物轉(zhuǎn)化[5]、光催化氧化[6]、吸附[7]、生物吸收[8]以及酶水解[9]等。微生物降解是降低PAEs污染的主要應用方法，但是它在自然環(huán)境中對PAEs的水解速度慢、效率低，且很難降解帶有長鏈的PAEs。酶水解是一種高效降低PAEs污染的方法，有研究報道利用角質(zhì)酶和酯酶可高效降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP][9]，但是由于天然酶復雜的制備工藝、低穩(wěn)定性、高成本以及嚴格的反應介質(zhì)使得天然酶的應用受到限制。因此開發(fā)一種既具有天然酶的催化活性又能克服天然酶本身弱點的人工模擬酶具有重要的科學價值。

近年來，以天然酶為模擬對象的模擬酶受到研究者的廣泛關(guān)注，他們主要是通過模擬天然酶的催化機制和結(jié)構(gòu)特征來獲得催化活性。目前，常用做酯酶模擬物的材料有金屬有機骨架[10]、碳納米管[11]、氧化石墨烯[12]、聚合物[13]、多肽[14-15]等。絲氨酸蛋白酶作為一種重要的水解酶，可以有效水解酯鍵[16]。本研究以價格低廉的微晶纖維素作為骨架材料，連接絲氨酸蛋白酶活性位點氨基酸（絲氨酸、組氨酸、天冬氨酸），也稱為催化三聯(lián)體[17]，構(gòu)建一種酯酶模擬物，并研究此模擬酶對PAEs的降解效果，為食品和工業(yè)領(lǐng)域中塑化劑的降解提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；高碘酸鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、硼氫化鈉、鹽酸羥胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴化鉀（分析純）：上海笛柏化學品技術(shù)有限公司；百里香酚藍（分析純）：上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；組氨酸（H）、天冬氨酸（D）、絲氨酸（S）、色氨酸（W）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（色譜純）、鄰苯二甲酸（phthalic acid，PA，純度 99.5%）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP，純度99%]、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP，純度 99%）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP，純度 99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500熒光分光光度計：日本Hitachi公司；TG16-Ⅱ離心機：長沙平凡公司；Merlin Compact掃描電子顯微鏡：德國Zeiss公司；QP2010 Ultral氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：日本島津公司；X射線光電子能譜儀（ESCALAB-MKII）：英國VG公司；傅里葉紅外光譜儀（IS 50）：美國 Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 二醛基纖維素的制備

參照文獻制備二醛基纖維素[18]：精確稱取7.2 g微晶纖維素溶于445 mL水中，配置成懸濁液，再稱取11.4 g高碘酸鈉迅速加入到含有MCC的懸濁液中，為避免光照導致的氧化分解，反應需在避光下進行。將上述反應瓶置于磁力攪拌器上，在水浴溫度48℃，轉(zhuǎn)速1 000 r/min條件下進行攪拌。反應19 h后，將瓶中反應物進行離心，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，離心時間5 min，棄去上清液，沉淀加入超純水重復多次進行離心洗滌，得到二醛基纖維素（2，3-dialdehyde cellulose，DAC）。

1.3.2 二醛基纖維素氧化程度的測定

利用鹽酸羥胺滴定法測定DAC的氧化度值（oxidation degree，OD）[19]，DAC 中的醛基可以與鹽酸羥胺的氨基通過席夫堿反應，然后用氫氧化鈉滴定反應釋放出鹽酸來計算氧化度。計算公式如下。

式中：V2為DAC消耗氫氧化鈉的量，mL；V1為空白試驗消耗氫氧化鈉的量，mL；C為氫氧化鈉的濃度，mol/L；m為稱取的質(zhì)量，g；161為纖維素中單位葡萄糖轉(zhuǎn)化為50%二醛基的平均分子量。

1.3.3 氨基酸與纖維素復合材料的制備

稱取0.1 g DAC溶于3.6 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，25 mmol/L） 中，加入 0.4 mL 100 mmol/L氨基酸（amino acids，AAs）溶液，在25℃條件下攪拌反應6 h，再加入20 μL 2 mol/L硼氫化鈉還原席夫堿。反應結(jié)束后，混合物置于透析袋中透析12 h，以除去未反應的氨基酸，從而得到氨基酸與纖維素復合材料（DAC-AAs）。

1.3.4 氨基酸與纖維素復合材料的表征

1.3.4.1 紅外光譜測定

傅里葉紅外光譜是一種靈敏度高的檢測技術(shù)，它可以對樣品的官能團及結(jié)構(gòu)進行鑒定，以確定樣品種類和性質(zhì)。試驗取復合材料與溴化鉀混勻、研磨、壓片后在25℃的條件下進行測定，儀器參數(shù)設(shè)置為掃描分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)36次，掃描范圍4 000 cm-1～500 cm-1。使用OMNIC軟件對獲得圖譜進行分析。

1.3.4.2 X射線衍射測定

試驗將復合材料放入X射線衍射儀樣品室中，儀器參數(shù)設(shè)置為掃描范圍 3°～50°，掃描速度 4°/min，然后進行測定。試驗所得X射線衍射譜圖用jade程序進行分析。

1.3.4.3 掃描電子顯微鏡測定

掃描電子顯微鏡通過電子束轟擊樣品表面，與樣品表面相互作用而產(chǎn)生二次電子來對樣品的形貌進行表征。試驗用導電膠將樣品固定，在5 kV電壓下，通過具有牛津能量色散譜儀掃描電子顯微鏡對復合材料進行測量分析，得到其對應的掃描電子顯微鏡圖。

1.3.5 纖維素上連接的氨基酸定量

通過測定色氨酸（W）的熒光光譜來定量連接到纖維素上的氨基酸量。在激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長350 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm的條件下測定熒光光譜。

1.3.6 氨基酸與纖維素復合材料水解活性的測定

取400 μL復合材料溶液加入550 μL Tris緩沖液中，再加入 50 μL PAEs（2 000 mg/L），置于恒溫振蕩器上反應48 h。反應結(jié)束后，用正己烷提取反應物，取上層有機相用于GC-MS測定。試驗以未加復合材料作為對照組。測定條件如下：采用DB-5柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氦氣作為載氣；不分流進樣；進樣量為1 μL；色譜柱升溫程序：初始溫度100℃，保持3 min，以10℃/min升溫至300℃，保持7min。質(zhì)譜條件：EI離子源；電離能量為70 eV；離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為250℃；離子采用全掃描方式檢測。

降解率計算公式如下。

式中：Ct是試驗組的 PAEs濃度，mg/L；C0是對照組中PAEs濃度，mg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用origin 8軟件進行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

MCC、DAC和DAC-AAs的紅外光譜圖見圖1。

圖1 MCC、DAC和DAC-AAs的紅外光譜圖Fig.1 Founer transform infrared spectra of MCC，DAC and DAC-AAs

由圖1可知，3 416 cm-1處的吸收峰是葡萄糖單元中的O-H伸縮振動峰；2 934 cm-1處的吸收峰是吡喃葡萄糖環(huán)上的-CH2振動吸收峰[18]。相比于MCC，制備的氧化度78%的DAC在1 730 cm-1處呈現(xiàn)吸收峰，這是醛基（-CHO）的特征吸收峰；885 cm-1處是半縮醛的伸縮振動峰，這些說明MCC上C2-C3位上的仲羥基被成功氧化為醛基。當連接氨基酸后，1 730 cm-1處的峰變小，DAC-AAs在1 394 cm-1處出現(xiàn)新的峰，這是CN伸縮振動吸收峰，在1 149 cm-1是氨基酸羧基上的C-O振動，說明氨基酸被成功連接到纖維素上。

2.2 X-射線衍射分析

MCC、DAC和DAC-AAs的X射線衍射圖譜見圖2。

圖2 MCC、DAC和DAC-AAs的X射線衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction patterns of MCC，DAC and DAC-AAs

X-射線衍射分析是測定聚合物結(jié)晶度的常用手段，利用其衍射圖譜可以定性物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)。從圖2可以看出，在MCC的內(nèi)部存在著明顯的結(jié)晶區(qū)，2θ 為 15.5°、22.5°、34.4°處有強的衍射峰。當 MCC 經(jīng)過NaIO4氧化為DAC后，衍射峰減少，僅在22.5°附近存在小衍射峰，說明纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，纖維素大分子從高度有序排列變成無序排列。當連接氨基酸后，DAC-AAs沒有衍射峰出現(xiàn)，說明沒有結(jié)晶結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

2.3 掃描電子顯微鏡分析

MCC、DAC和DAC-AAs的掃描電子顯微鏡圖見圖3。

圖3 MCC、DAC和DAC-AAs的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of MCC，DAC and DAC-AAs

由圖3可知，MCC的表面較光滑；DAC表面變得褶皺粗糙，呈現(xiàn)了裂紋和深淺不一的侵蝕條紋，說明NaIO4對MCC的結(jié)構(gòu)具有侵蝕作用，這可能是由于經(jīng)過NaIO4氧化之后，脫水葡萄糖單元的C2-C3鍵被破壞了，而葡萄糖苷環(huán)的斷裂導致了表面的不平整，進一步增大了分子間的孔隙[20]。DAC-AAs是DAC進一步修飾氨基酸后的形貌，與DAC比形貌未發(fā)生較大變化，但粗糙面和侵蝕條紋更加明顯。

2.4 定量纖維素上連接的氨基酸

不同濃度色氨酸的熒光光譜和定量色氨酸濃度的標準曲線圖見圖4。

圖4 不同濃度的色氨酸的熒光光譜和用于定量色氨酸濃度的標準曲線Fig.4 Fluorescence spectra of different concentrations of tryptophan and a standard curve for quantifying tryptophan concentration

試驗采用熒光定量的方法來量化連接在纖維素上的氨基酸量。色氨酸（W）是天然氨基酸中具有熒光性質(zhì)的氨基酸，在激發(fā)波長為280 nm處，它的發(fā)射波長為350 nm。用色氨酸代替絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸結(jié)合到纖維素上，根據(jù)濃度及濃度對應的熒光強度繪制標準曲線，計算得到連接到纖維素上的氨基酸量為4.15 mg。

2.5 模擬酶的水解試驗

為了驗證構(gòu)建的模擬酶是否具有降解塑化劑的能力，首先選擇塑化劑中分布最廣且占有率最高的DEHP為降解底物。據(jù)報道世界上40%～50%的PAEs是DEHP[21]，它廣泛分布于液體食物中，如橄欖油（＞24 μg/g）、牛奶（約215μg/L）、白酒（5mg/kg）以及飲用水（約3.47μg/L）、地表水（0.013μg/L～18.5μg/L）、地下水（約 5.66μg/L）、污水（0.716 μg/L ～122 μg/L）中[3，22-24]。

試驗分別研究了 DAC、H、S、D、DAC-H、DAC-S、DAC-D、DAC-HS、DAC-HD、DAC-SD、DAC-HSD 對DEHP的降解活性見圖5。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAC不能夠降解DEHP，而單獨的氨基酸中除了H表現(xiàn)出較低的降解活性外，S和D均未顯示出降解DEHP的能力，這是由于游離氨基酸沒有形成一定的結(jié)構(gòu)因而活性低。當氨基酸與纖維素結(jié)合后，構(gòu)成的模擬酶對DEHP的降解能力均高于單獨的氨基酸，說明纖維素作為支架材料有促進水解的作用；且DAC-H降解能力高于DAC-S，說明組氨酸對于模擬物水解活性起到重要作用，因為組氨酸的咪唑基在質(zhì)子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中既可以接受也可以給予質(zhì)子[15，25]。相比于含兩個氨基酸的復合材料，具有催化三聯(lián)體的復合材料模擬酶具有最高的活性，對DEHP的降解率可以達到60.1%，這可能是由于天冬氨酸（D）羧基與組氨酸（H）咪唑基通過氫鍵作用，增加了組氨酸咪唑基上氮原子的pKa值，使其成為堿；咪唑基上的氮對絲氨酸羥基去質(zhì)子作用，進一步對底物進行親核進攻。

圖5 不同的氨基酸與醛基化纖維素為基礎(chǔ)的模擬酶對DEHP的降解Fig.5 The DEHP degradation rates by different DAC-AAs

2.6 溫度對模擬酶催化活性的影響

溫度對于模擬酶DAC-HSD降解DEHP的影響見圖6。

圖6 溫度對于模擬酶DAC-HSD降解DEHP的影響Fig.6 The effect of temperature on the degradation rates of DEHP by DAC-HSD

反應溫度會影響活性位點的構(gòu)型和酸堿催化中心取向。由于不同的熱穩(wěn)定性，酶具有各自最佳溫度，催化反應的速率通常隨溫度增加，但是當酶達到最佳溫度時，由于酶是自然界中的蛋白質(zhì)，當繼續(xù)升高溫度，可能促使酶失活，反而導致酶促反應速率降低[26]。在氨基酸和纖維素組合物的模擬酶系統(tǒng)中，結(jié)果表明模擬酶的降解率隨轉(zhuǎn)變溫度的升高先升高后降低，并且在40℃的溫度條件下降解率達到最大值。結(jié)果表明，模擬酶DAC-HSD的最佳反應溫度為40℃。

2.7 pH值對復合材料催化活性的影響

pH值對于模擬酶DAC-HSD降解DEHP的影響見圖7。

圖7 pH值對于模擬酶DAC-HSD降解DEHP的影響Fig.7 The effect of pH on the degradation rates of DEHP by DAC-HSD

pH值是影響酶活性的另一個重要因素，它通過影響酶分子中氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)影響底物與酶分子間電荷轉(zhuǎn)移，從而影響酶與底物的結(jié)合，最終影響酶催化的反應速度[26]。

當反應溶液的pH值高于或低于最適pH值時都會使酶的催化活性下降，且過酸或過堿還會導致酶變性失活。在氨基酸與纖維素復合材料的模擬酶體系中，結(jié)果表明在pH 6～10范圍內(nèi)，模擬酶對DEHP的降解率隨pH值的升高先增加，當pH值為9.0時，降解率達到最大值，之后隨著pH值的繼續(xù)升高，模擬酶對DEHP的降解率呈下降趨勢。表明復合材料模擬酶DAC-HSD的最佳pH值為9.0。

2.8 模擬酶對DEHP、DBP、DMP 3種底物降解的比較

模擬酶DAC-HSD對DMP、DBP和DEHP降解率見圖8。

圖8 模擬酶DAC-HSD對DMP、DBP和DEHP降解率的比較Fig.8 The degradation rates of DMP，DBP and DEHP by DAC-HSD

DBP和DMP是僅次于DEHP被普遍使用的塑化劑[3]，因此選擇這兩種塑化劑進一步研究模擬酶是否具有降解另外兩種底物的能力。

由圖8可知，模擬酶對DEHP具有最高的降解率，其次是DBP、DMP，降解率順序為：DEHP（60.1%）>DBP（14%）>DMP（9.9%）。這可能是由于側(cè)鏈烷基鏈的長短影響了降解率，具有相對較短側(cè)鏈的塑化劑在此模擬體系中較難降解，而鏈長的塑化劑則容易降解，這可能由于鏈長的PAEs相比于鏈短的PAEs對酶的親和力更高[5]。

2.9 分析降解產(chǎn)物

模擬酶對DEHP的降解及產(chǎn)物分析見圖9。

圖9 GC-MS對DEHP降解及中間產(chǎn)物檢測色譜圖Fig.9 GC-MS chromatograms of DEHP and its degradation intermediates

DEHP降解后會產(chǎn)生相應的產(chǎn)物，試驗進一步考察降解后產(chǎn)物，由圖9可以看出，DEHP經(jīng)過模擬酶DAC-HSD降解48 h后，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物是鄰苯二甲酸（PA），出峰位置在14.17 min。

3 結(jié)論

隨著酶模擬物研究的迅速發(fā)展以及它們的突出優(yōu)點，酶模擬物有可能成為天然酶最有力的競爭者，用于食品工業(yè)、化學、醫(yī)學診斷等廣泛領(lǐng)域，因此設(shè)計一種成本低、活性高的模擬酶愈發(fā)重要。本試驗以成本低廉的MCC為原料，通過NaIO4選擇性氧化2，3位羥基為雙醛基，形成的DAC進一步通過席夫堿反應連接氨基酸，最后形成氨基酸-纖維素復合材料模擬酶。通過測定對DEHP塑化劑的降解率，證實DAC-HSD為最優(yōu)模擬酶，它可以在pH 9.0、溫度40℃條件下48 h內(nèi)有效降解60.1%的DEHP；試驗還進一步比較對另外兩種塑化劑DMP和DBP的降解，發(fā)現(xiàn)降解率順序：DEHP>DBP>DMP。本研究設(shè)計了一種經(jīng)濟有效的氨基酸-纖維素復合材料模擬酶，可以為食品和工業(yè)領(lǐng)域DEHP的降解提供重要參考。