阮易柔,吳智華,吳士筠,鐘祖昌,覃瑞,劉虹

(中南民族大學 生命科學學院, 武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室， 武漢 430074)

隨著全球氣候變暖與極端自然災害的頻繁發(fā)生，高山植物的生存受到了一定的威脅. 高山植物的自然更新關鍵取決于種子的成熟、萌發(fā)與生長等連續(xù)性過程. 種子萌發(fā)是一系列有序的生理變化和形態(tài)發(fā)生過程，需要適宜的環(huán)境條件，如水分、空氣和溫度等. 當植物種子從高山轉移至平原地區(qū)后，各種環(huán)境條件發(fā)生改變，有可能制約種子的萌發(fā).

金腰屬植物富含黃酮和三萜類化合物，具有良好的抗腫瘤和抗病毒作用[1-3]. 中華金腰(Chrysospleniumsinicum)為多年生草本植物，生長在海拔800～3500 m且生態(tài)環(huán)境較為原始的林下溝邊.中華金腰分布于我國大部分省區(qū). 中華金腰作為一種民間中草藥被記載，俗稱華金腰子，全草入藥，具有清熱退黃的作用[4-9]. 因其種子細小、種皮堅硬、休眠性強，在自然條件下萌發(fā)率較低，因此多為無性繁殖. 同時中華金腰對生長環(huán)境要求較高，難以進行人工種植,局限了中華金腰的研究和應用.本研究擬通過光照、低溫、赤霉素等因素對種子萌發(fā)的影響來探究中華金腰種子的萌發(fā)特性,同時為金腰屬植物的種子萌發(fā)和快速繁殖提供科學參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中華金腰(Chrysospleniumsinicum)植株于2019年3月采集于湖南省八大公山國家級自然保護區(qū)，后移植于中南民族大學實驗苗圃，定期澆水. 2019年4月待果實成熟后收獲種子.

1.2 儲存方式處理與形態(tài)觀察

中華金腰種子在常溫下用硅膠進行干燥. 掃描電鏡(SU 8010型，日立)對干燥后的種子進行形態(tài)觀察并拍照. 種子采用常溫避光儲存與4 ℃低溫種子柜儲存兩種存儲處理方式，并分別進行萌發(fā)實驗.

1.3 光處理

設置2個光處理水平，分別為光照環(huán)境與黑暗環(huán)境. 光照處理環(huán)境溫度為22 ℃，光照強度為3000 lx，光照時間16 h/d. 黑暗環(huán)境溫度為22 ℃.

1.4 低溫處理

設置5 ℃的低溫處理水平，低溫分別處理2周、3周和4周，然后再進行自然萌發(fā). 萌發(fā)溫度22 ℃，光照強度3000 lx，光照時間為16 h/d.

1.5 赤霉素浸種處理

對于赤霉素處理設計梯度實驗，浸種時間設3個水平分別為12、24、36 h，赤霉素濃度設6個水平分別為0、50、100、150、200、250 mg/L，進行種子浸泡處理，然后自然萌發(fā)，環(huán)境溫度為22 ℃，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/d.

1.6 數據統(tǒng)計與處理

根據每天記錄的發(fā)芽情況，進行發(fā)芽各項指數的計算及分析. 體式顯微鏡(Stemi 305,德國蔡司)下觀察種子形態(tài)，以胚根露出2 mm記為萌芽. 從處理當天開始，每24 h記錄一次發(fā)芽狀態(tài). 連續(xù)3 d萌發(fā)數不變則視為萌發(fā)進程結束. 統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)時滯、發(fā)芽持續(xù)時間、發(fā)芽指數. 實驗所得數據用Excel 2016與SPSS 19.0進行作圖與數據分析.

(1)發(fā)芽率=(種子發(fā)芽總數/供試種子總數)×100%

(2)發(fā)芽勢=(發(fā)芽達到最高峰時的種子數/供試種子總數)×100%

(3)萌發(fā)時滯：從發(fā)芽試驗開始那天到第一個種子萌發(fā)的所需的時間.

(4)發(fā)芽持續(xù)時間：從種子開始萌發(fā)至最后一粒種子萌發(fā)的天數.

(5)發(fā)芽指數=∑(Gt/Dt)，Gt表示在試驗期內種子發(fā)芽數，Dt表示試驗期天數[10-12].

2 實驗結果

2.1 種子形態(tài)特征

中華金腰種子形態(tài)特征如圖1所示. 種子長度約0.6 ～ 0.9 mm，直徑約0.45 mm，黑褐色，呈卵球形至橢球形，兩端頓尖，具一條縱肋，表面密被乳頭突起. 種皮堅韌，對其萌發(fā)有一定的限制作用. 表面的突起可能對于其通過水流進行飄流傳播有一定的作用. 百粒法測定千粒重為(0.0503 ± 0.0007)g.

圖1 中華金腰種子掃描電鏡圖Fig.1 Seed image of Chrysosplenium sinicum

2.2 儲存方式對中華金腰種子萌發(fā)的影響

通過對兩種不同儲存方式的種子進行萌發(fā)實驗，發(fā)現萌發(fā)率具有顯著的差異. 對室內干燥避光條件下儲存的種子進行萌發(fā)實驗，中華金腰種子在室內自然條件與赤霉素處理后均不能萌發(fā). 儲存于4 ℃低溫種子柜內一個月后再進行萌發(fā)實驗，自然條件下萌發(fā)率為6.67%，經過100 mg/L GA3浸種處理24 h后最大萌發(fā)率為31.67 %. 儲存于低溫種子柜內2個月后進行萌發(fā)實驗，發(fā)現室內條件下自然萌發(fā)率提高到86.67 %，差異極顯著(P< 0.01)(圖2). 而對植株上新鮮收取的種子進行萌發(fā)實驗，發(fā)現不能自然萌發(fā).因此推斷中華金腰種子具有后熟休眠特性，且低溫春化作用對其萌發(fā)有益.

(o)未經任何處理的對照組；(a)4 ℃低溫儲存一個月后自然萌發(fā)；(b)4 ℃低溫儲存一個月后經過100 mg/L GA3 浸種處理24 h后萌發(fā)；(c)低溫儲存2個月后進行自然萌發(fā)圖2 儲存方式對發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of storage methods on germination rate

2.3 光照對中華金腰種子萌發(fā)的影響

對比光照與黑暗處理后萌發(fā)各項指數，光照處理的種子發(fā)芽率為86.67 %、發(fā)芽勢為54.44 %與發(fā)芽指數為9.84,顯著(P< 0.05)高于黑暗處理的發(fā)芽率68.89 %、發(fā)芽勢30.00 %與發(fā)芽指數6.69，且光照條件下萌發(fā)時滯與發(fā)芽持續(xù)時間較黑暗處理更具優(yōu)勢(圖3). 因此光照較之黑暗更有利于中華金腰種子的萌發(fā).

圖3 光照與黑暗對萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of light and darkness on germination

2.4 低溫處理對中華金腰種子萌發(fā)的影響

低溫處理對中華金腰種子的萌發(fā)具有顯著影響(表1)，隨低溫處理時間的增加，發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈現先減后增的趨勢，萌發(fā)指數呈現顯著上升趨勢，萌發(fā)時滯與發(fā)芽持續(xù)時間顯著減少. 將無低溫處理(即低溫處理時間為0)作為對照組. 在處理2周后，發(fā)芽率顯著降低到74.44 %，在處理3周、4周后，發(fā)芽率相對于處理2周組顯著增加到86.67 %. 發(fā)芽勢在處理2周時為36.67 %，處理4周后顯著增加到 70.00 %. 處理4周后，萌發(fā)時滯和發(fā)芽持續(xù)時間從對照組的10.33 d與12.33 d顯著降低到 2.33 d與 7.00 d；發(fā)芽指數從對照組的9.84 顯著增加到19.72 (P< 0.05).

表1 低溫處理對中華金腰種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of low temperatureon on the seed germination of Chrysosplenium sinicum

2.5 赤霉素浸種處理對中華金腰種子萌發(fā)的影響

赤霉素浸種處理對中華金腰萌發(fā)各項指數的影響見表2，在赤霉素濃度與浸種時間的交互作用下，中華金腰種子的各項萌發(fā)指數呈現出不同的變化(P<0.05). 以赤霉素濃度為0作為對照，可知種子發(fā)芽率最高的處理條件為150 mg/L GA3浸種12 h，發(fā)芽率最高為 97.78 %，在200 mg/L GA3浸種24 h時，發(fā)芽率最低為 83.33 %，且低于對照組. 發(fā)芽率隨赤霉素濃度增加呈現先升高再減小的變化趨勢，在赤霉素濃度為150 mg/L時達到最大. 赤霉素濃度的變化對發(fā)芽勢影響顯著，處理條件為250 mg/L GA3浸種36 h時，發(fā)芽勢達到最大80.00 %，在0 mg/L GA3浸種24 h時，發(fā)芽勢最低為36.67 %，浸種時間在0 mg/L GA3與200 mg/L GA3時影響顯著，呈現先減后增的趨勢. 赤霉素濃度的變化對萌發(fā)時滯影響顯著，總體隨著赤霉素濃度增加而減小，處理條件在50 mg/L GA3浸種24 h時萌發(fā)時滯最小為3.33 d，組內萌發(fā)時滯隨浸種時間增加而增加. 赤霉素濃度的變化對發(fā)芽持續(xù)時間影響顯著，處理條件在250 mg/L GA3浸種36 h時萌發(fā)時滯最小為 5.00 d. 在赤霉素濃度相同的組內，浸種時間對于發(fā)芽持續(xù)時間影響顯著，隨著浸種時間增長而減少. 赤霉素濃度變化對于發(fā)芽指數影響不顯著，浸種時間對于發(fā)芽指數影響顯著，且隨浸種時間增加而減小，處理條件在0 mg/L GA3浸種12 h時發(fā)芽指數最大為14.79.

表2 赤霉素濃度與浸種時間對中華金腰種子萌發(fā)的影響Tab.2 Effect of GA3 concentration and soaking time on the seed germination of Chrysosplenium sinicum

3 討論

種子自身特性與環(huán)境因子是影響種子萌發(fā)的主要因素. 對于高山植物來說，種子休眠是影響其萌發(fā)的重要生理特征，通過種子休眠可以幫助高山植物度過惡劣的環(huán)境. 本研究結果表明中華金腰種子在植株上成熟后不能立即萌發(fā)，需要經過一段時間低溫儲藏后才具有較高的發(fā)芽率，表明其具有后熟休眠特性. 此外，本研究結果表明光照有利于中華金腰種子的萌發(fā).

有研究表明[17, 18]，高山植物種子萌發(fā)前需經過冷層積的過程，且萌發(fā)率顯著高于未經過冷層積的種子. 本研究表明低溫處理可以縮短中華金腰種子的萌發(fā)時滯，且呈明顯負相關；發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數隨低溫處理時間增多而增加，呈正相關關系，驗證了高山植物需經冷層積過程這一觀點.

赤霉素是一種廣譜植物生長促進激素，參與植物生活史的多個過程. 在農業(yè)生產中常用來促進種子的萌發(fā). 本研究結果表明適宜濃度的赤霉素能促進中華金腰種子的萌發(fā). 赤霉素濃度在150 mg/L浸種12 h時，中華金腰種子發(fā)芽率達到最高97.78 %. 設置赤霉素濃度梯度可以探究適合于中華金腰種子萌發(fā)的結果與種子喜好的赤霉素濃度的關系. 本研究中設置的赤霉素濃度范圍還不夠廣，部分發(fā)芽指標差異不夠明顯，后續(xù)將進一步拓展加深.

高山植物由于其特殊的生境而對環(huán)境和人為條件非常敏感. 適宜的環(huán)境條件可以促進種子的萌發(fā)，當超過一定的范圍后反而會抑制萌發(fā). 除了非生物因素，生物因素也是影響高山植物在低海拔地區(qū)萌發(fā)的重要條件. 綜合多種因素的探究能更加全面且客觀地給中華金腰這種高山植物在低海拔地區(qū)的生長繁殖及進一步的種質資源研究提供有價值的依據. 本研究也為同屬其他物種的種質資源保護與擴繁提供了科學依據.