沈金花，曾曉月

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

支氣管哮喘，簡稱哮喘，是一種以可逆性支氣管收縮、黏液增生以及氣道高反應(yīng)性為特征的慢性氣道疾病[1].哮喘的發(fā)病機制十分復(fù)雜且因人而異，如離子通道病變、免疫系統(tǒng)紊亂、基因異常、炎癥反應(yīng)及呼吸道結(jié)構(gòu)的改變等.哮喘已成為嚴重威脅全人類健康的慢性疾病之一，也給患者和全社會帶來了沉重的負擔(dān).臨床上常用的治療哮喘的藥物主要有茶堿、β2受體激動劑、抗膽堿藥、皮質(zhì)激素等[2].中藥治療哮喘具有悠久的歷史，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究，有望發(fā)現(xiàn)可靠有效的用于治療或緩解哮喘的中藥[3].

白茅根(Rhizomaimperatae)為禾本科植物白茅的干燥根莖.其性味甘寒，具有涼血、清熱利尿的作用，主要活性成分有糖類、三萜類、黃酮類等.目前，白茅根已經(jīng)在治療惡性腫瘤、慢性肝炎、過敏性皮炎等方面得到應(yīng)用[4].目前，尚未見文獻報道過白茅根對哮喘的作用.因此，本文提取白茅根乙酸乙酯部來檢測此物對小鼠氣管平滑肌的影響，以此探究其對哮喘的影響.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

白茅根(北京同仁堂藥房)；膠原蛋白酶、木瓜蛋白酶、牛血清蛋白、乙酰膽堿、硝苯地平(美國Sigma).生理鈣溶液、零鈣溶液、rTASM 解離液、細胞外液、電極內(nèi)液、酶Ⅰ、酶Ⅱ，參考文獻[2]配置.

HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技)；張力換能器( JH-2型，北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；膜片鉗放大器(EPC-10，德國HEKA)；膜片鉗顯微鏡(IX51，日本OLYMPUS)；MP-225顯微操作儀、P-97 Flaming/Brown電極拉制儀(美國Sutter Instrument Company)；玻璃微電極(外徑1.4 mm，南京泉水教學(xué)實驗器材廠)；玻璃微電極拋光儀(2002-C，華中科技大學(xué))；中草藥粉碎機(FW135，天津市秦斯特儀器).

8周齡BABL/c雄性小鼠，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心,嚴格按照《中南民族大學(xué)實驗動物使用與福利指導(dǎo)手冊》的指導(dǎo)方案進行動物研究和處理.

1.2 白茅根乙酸乙酯部提取物的制備

將白茅根粉碎，稱取白茅根粉1000 g于室溫下浸泡于80% 的乙醇溶液5 d(固液比1∶16 ).過濾得濾液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得乙醇浸膏.依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取此浸膏，獲得相應(yīng)的提取物.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)浸膏獲得白茅根乙酸乙酯部提取物，并置于真空干燥箱中保存?zhèn)溆?

1.3 小鼠離體氣管環(huán)的處理與上樣

斷頸法處死小鼠，取出小鼠氣管組織，置于盛有冰浴PSS的解剖盤中將主氣管周圍多余組織清理干凈.最終在靠近氣管三角區(qū)剪取長約7 mm的氣管，將其用兩個三角鉤固定住后掛到張力換能器上，置于預(yù)熱的含有6 mL PSS的恒溫水浴槽內(nèi)，水浴槽內(nèi)保持持續(xù)通氧狀態(tài)，水浴溫度維持在37 ℃.上樣后，將初始前負荷調(diào)節(jié)為約300 mg并持續(xù)15 min，每15 min后更換PSS溶液，重復(fù)4次.平衡結(jié)束后，使用80 mmol·L-1KCl或100 μmol·L-1ACh進行預(yù)刺激，使離體氣管環(huán)獲得充分刺激，再用PSS洗脫使其恢復(fù)至基線，組織在基線狀態(tài)休息30 min后開始實驗.

1.4 小鼠氣管平滑肌細胞的制備

將獲得的氣管及肺組織迅速固定于含有冰浴解離液的解剖盤中，將主氣管及支氣管周圍多余組織清除，并剪下呈“Y”形的肌條組織.快速置于預(yù)熱(37 ℃)的P酶中，每6～7 min中輕彈幾下EP管使肌條組織伸展開，共消化21～23 min.在P酶中消化完后，將肌條組織轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的H酶中，5 min后，用冰浴的BSA溶液清洗兩次，然后將組織轉(zhuǎn)移到一約含500 μL的BSA溶液的EP管中，通過彈EP管使肌條組織分散成單個細胞.打開EP管蓋，置于0 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.5 全細胞電流記錄

通過EPC-10膜片鉗，采用步階式(從-70 mV～+40 mV)刺激方式作用于細胞，階刺激為1000 ms.記錄小鼠單個氣管平滑肌細胞L型鈣離子通道全細胞電流.

2 結(jié)果與分析

2.1 EAERI對高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

EAERI能劑量依賴性舒張由高鉀溶液誘導(dǎo)的小鼠離體氣管環(huán)的收縮，最大舒張比值為(99.7±0.9)%，IC50=0.66 mg·mL-1,IC75=1.053 mg·mL-1(圖1a，1b)，選取IC75用于后續(xù)實驗.10 μmol·L-1Nifedipine(L型鈣通道的一種選擇性阻斷劑)可以完全舒張由高鉀誘導(dǎo)的收縮的小鼠離體氣管環(huán)(圖1c)，并且對靜息狀態(tài)下的氣管環(huán)張力無影響(圖1d).因此，可知EAERI通過抑制L型鈣通道來舒張由高鉀誘導(dǎo)的氣管環(huán)的收縮.

2.2 EAERI抑制高鉀誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流

在0 Ca2+條件下，高鉀不能誘導(dǎo)離體氣管的收縮，而浴液恢復(fù)到生理鈣環(huán)境后可引發(fā)氣管收縮.此收縮可被1.053 mg·mL-1EAERI抑制(圖2a).在提前孵育1.053 mg·mL-1EAERI條件下，浴液由零鈣溶液恢復(fù)到生理鈣溶液后，高鉀僅引起離體小鼠氣管環(huán)一個輕微短時的收縮(無統(tǒng)計學(xué)意義)后即恢復(fù)到基線(圖2b)，表明EAERI通過抑制Ca2+經(jīng)L型鈣離子通道流入細胞內(nèi)，由此舒張由高鉀誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)的收縮.

a) EAERI劑量依賴性地抑制高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)；b) EAERI抑制高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的量效曲線；c) 10 μmol·L-1 Nifedipine完全阻斷高鉀誘導(dǎo)離體小鼠氣管環(huán)的收縮；d) EAERI對小鼠離體氣管環(huán)靜息狀態(tài)下張力無影響圖1 EAERI對高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用(n=6)Fig.1 Relaxation effect of EAERI on the precontracted trachea induced by high K+(n=6)

a) 無外鈣條件下高鉀不引起氣管收縮；b) 提前孵育EAERI可抑制外鈣內(nèi)流引起的氣管收縮圖2 EAERI對高鉀誘導(dǎo)的外鈣內(nèi)流的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of EAERI on Ca2+ influx induced by high K+

2.3 EAERI抑制L型鈣通道全細胞電流

記錄急性分離的氣管平滑肌細胞的L型鈣通道電流時采用步階電壓刺激(-70 mV～+40 mV),發(fā)現(xiàn)EAERI阻斷L型鈣通道電流的變化情況與Nifedipine的效果一致(圖3).當(dāng)不存在Nifedipine或者EAERI時，在刺激電壓大于-30 mV后開始出現(xiàn)L型鈣通道電流并逐漸增大，而在刺激電壓大于10 mV后電流隨即呈變小趨勢；當(dāng)加入Nifedipine或EAERI后，電流能被抑制，表明EAERI的作用與Nifedipine類似，即EAERI能通過阻斷L型鈣離子通道抑制細胞外Ca2+流入細胞內(nèi).

乙酰膽堿(ACh)是一種常見的神經(jīng)遞質(zhì)，可作為激動劑作用于平滑肌細胞膜上的離子通道，使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，最終引起氣管平滑肌收縮，其主要作用于鈣離子通道(VDCCs)和非選擇性陽離子通道(NSCCs)[5-6].由ACh引起的氣管環(huán)的預(yù)收縮也能被EAERI劑量依賴性地抑制(圖4a)，舒張值為(99.68±0.47)%，IC50=1.053 mg·mL-1，IC75=1.584 mg·mL-1(圖4b)，說明EAERI能舒張由ACh誘導(dǎo)氣管環(huán)的收縮.

a) EAERI作用于氣管平滑肌細胞的VDCCs時間-電流圖；b) EAERI作用于氣管平滑肌細胞的VDCCs電壓-電流圖圖3 EAERI對VDCCs電流的阻斷作用Fig.3 Inhibitory effect of EAERI on VDCCs currents

a) EAERI抑制ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的量效曲線;b) EAERI劑量依賴地抑制ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)圖4 EAERI對ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用Fig.4 Relaxation effect of EAERI on precontracted tracheal ring induced by ACh

先由ACh誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生一個穩(wěn)定的收縮，加入Nifedipine后氣管環(huán)部分舒張，再加入1.584 mg·mL-1EAERI后氣管環(huán)可基本完全舒張(圖5a).

a)EAERI對排除VDCCs后的氣管環(huán)的影響；b,c) 排除VDCCs后EAERI 舒張ACh預(yù)收縮的氣管環(huán)的量效曲線圖5 排除VDCCs通道后EAERI對ACh誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用(n=6)Fig.5 Relaxation effect of EAERI on precontracted tracheal ring induced by ACh without VDCCs(n=6)

提前孵育Nifedipine，ACh仍能誘導(dǎo)小鼠氣管環(huán)產(chǎn)生穩(wěn)定收縮，說明除了L型鈣通道外還有其他通道參與此收縮，且該收縮呈劑量依賴性地被EAERI舒張(圖5b)，圖5c為舒張百分比統(tǒng)計圖.以上結(jié)果表明：除了L型鈣通道外，EAERI還能通過其他通道來舒張由ACh誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)的收縮.

2.4 EAERI抑制ACh誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放

細胞處于零鈣溶液下, ACh僅能誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生一個瞬時微弱的收縮，而當(dāng)細胞外溶液濃度恢復(fù)到生理溶液濃度后，氣管環(huán)可產(chǎn)生一個持續(xù)穩(wěn)定的收縮，且能被EAERI舒張(見圖6b，圖6a為對照組).在提前孵育EAERI的條件下，ACh不能誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生明顯收縮(圖6c).提前孵育Nifedipine，ACh仍能在零鈣條件下誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生一個瞬時微弱的收縮，同樣在恢復(fù)到生理鈣條件后可誘導(dǎo)小鼠氣管環(huán)產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的收縮，并能被EAERI舒張(圖6d).提前孵育Nifedipine，零鈣條件下ACh能誘導(dǎo)一個瞬時微弱的收縮，細胞外液換成生理溶液后氣管環(huán)出現(xiàn)一個持續(xù)穩(wěn)定的收縮，此收縮能被30 μmol·L-1Pyr3、30 μmol·L-1Gadolinium和EAERI各舒張一部分(圖6e和圖6f).以上實驗結(jié)果表明：EAERI可能通過阻斷NSCCs通道抑制內(nèi)鈣的釋放，進而舒張由ACh誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)的收縮.

a) ACh誘導(dǎo)的穩(wěn)定收縮依賴于外鈣內(nèi)流；b) EAERI對此條件下ACh誘導(dǎo)的氣管收縮的影響；c) 提前孵育EAERI, ACh不能誘導(dǎo)氣管環(huán)產(chǎn)生明顯收縮；d) 排除VDCCs影響，EAERI對ACh誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流的阻斷作用；e) 提前孵育Nifedipine，Gadolinium和Pyr3對ACh誘導(dǎo)的收縮的舒張作用；f) Gadolinium和Pyr3作用后， EAERI對其剩余收縮部分的舒張作用圖6 EAERI對ACh引起的內(nèi)鈣釋放的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of EAERI on Ca2+ influx activated by ACh

2.5 EAERI對組織活性的影響

當(dāng)EAERI作用于高鉀或ACh誘導(dǎo)的收縮的小鼠氣管環(huán)后，在洗脫掉EAERI后，再用高鉀或ACh刺激，氣管環(huán)都可再次產(chǎn)生收縮，但恢復(fù)不到原始狀態(tài)(圖7).此實驗結(jié)果表明：EAERI對預(yù)收縮的氣管環(huán)有舒張作用，而洗脫后氣管環(huán)無法恢復(fù)到原始狀態(tài).原因可能是由于瞬時的洗脫無法將藥物完全洗掉，殘留的藥物使得氣管環(huán)收縮力下降.

a) EAERI舒張ACh預(yù)刺激的氣管環(huán)后，將EAERI洗脫，用ACh再刺激組織，氣管環(huán)仍能收縮，但收縮力下降b) EAERI舒張高鉀預(yù)刺激的氣管環(huán)后，將EAERI洗脫，用高鉀再刺激組織，氣管環(huán)收縮力下降圖7 EAERI對組織活性的影響Fig.7 Effect of EAERI on tissue activity

3 討論

哮喘的發(fā)病機制復(fù)雜，有些甚至尚未闡明清楚，但是許多研究結(jié)果都表明：Ca2+相關(guān)的離子通道在哮喘中有著重要作用[7-9]，而氣管平滑肌細胞的過度收縮會威脅到哮喘患者的生命[10-11].目前，哮喘還無法得到根治，只能使用一些支氣管擴張藥物進行緩解治療[12-13].中醫(yī)治療哮喘的研究也在不斷進行，以期找到新型的用于治療哮喘的藥物[14].

用高鉀溶液或ACh溶液可以誘導(dǎo)氣管平滑肌異常收縮，以此來模擬哮喘發(fā)病時的狀態(tài).EAERI可以舒張由高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮的氣管環(huán)，與使用Nifedipine的作用效果一致.當(dāng)組織通過零鈣與生理鈣溶液轉(zhuǎn)換實驗,表明EAERI舒張高鉀誘導(dǎo)的氣管環(huán)收縮是由于EAERI抑制外鈣內(nèi)流.進一步通過單細胞水平記錄VDCCs電流，發(fā)現(xiàn)EAERI與Nifedipine一樣可以阻斷VDCCs電流，即EAERI通過阻斷L型鈣離子通道來抑制Ca2+內(nèi)流從而舒張氣管環(huán).ACh是一種常用的M受體激動劑,可以激活多種離子通道，使細胞外鈣內(nèi)流以及肌漿網(wǎng)中鈣外流到細胞質(zhì)中，最后使細胞質(zhì)中鈣離子濃度升高，從而出現(xiàn)氣管平滑肌收縮的現(xiàn)象.EAERI能夠舒張由ACh誘導(dǎo)的氣管環(huán)的收縮.預(yù)孵Nifedipine以排除L型鈣離子通道影響，發(fā)現(xiàn)EAERI仍能夠舒張剩余的收縮.進一步研究發(fā)現(xiàn)，TRPC通道阻斷劑Gadolinium和Pyr3可分別舒張此剩余的收縮，表明EAERI可以通過阻斷NSCCs抑制Ca2+內(nèi)流，從而舒張氣管環(huán).通過文獻分析發(fā)現(xiàn)，ACh還可以激活鉀離子通道及BK通道，此類通道的開放與否也與細胞的收縮舒張有關(guān)[15]. 因此，可進一步研究EAERI是否通過調(diào)節(jié)鉀離子通道而在舒張氣管平滑肌上起一定的作用.

綜上所述，EAERI可以通過抑制L型鈣離子通道、NSCCs通道來抑制細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而舒張氣管平滑肌.此研究提示EAERI有望成為一種支氣管擴張藥物用于治療哮喘.