廖貴芹, 程國(guó)軍, 吳和濤, 滕雪, 劉瑩

(1華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430074；2中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

葡萄糖異構(gòu)酶(GIase)能將D-葡萄糖、D-木糖等轉(zhuǎn)化為D-果糖、D-木酮糖等相應(yīng)酮糖[1].它是工業(yè)上從淀粉大規(guī)模制備高果糖漿(HFCS)的關(guān)鍵酶[2-4]，其酶活的高低直接關(guān)系到高果糖漿的產(chǎn)量和生產(chǎn)成本.

目前國(guó)產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶主要問題是酶學(xué)性質(zhì)不理想，即酶活低，熱穩(wěn)定性差、耐受金屬離子的能力差.葡萄糖異構(gòu)酶大多數(shù)來自于細(xì)菌、放線菌，小部分來自真菌[5-6].因此，篩選和構(gòu)建高生產(chǎn)性能的商業(yè)用葡萄糖異構(gòu)酶一直是研究的熱點(diǎn).為獲得高產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的優(yōu)良菌種，本文從土壤中分離得到一株產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶活比較高的細(xì)菌菌株，并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為后期優(yōu)化產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的條件奠定了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

本文中21份土樣采自湖北省等鄰近省份，來源于含水量較低、有機(jī)質(zhì)豐富的土壤[7].可見分光光度計(jì)(V-1000，上海翱藝儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-IIN型,寧波新芝生物科技有限公司,破碎條件：變幅桿Φ3，功率為40%, 工作時(shí)間4 s，停30 s，共238 s)；測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志公司).

1.2 培養(yǎng)基

(1)細(xì)菌初篩培養(yǎng)基：D-木糖5 g·L-1，硫酸銨2 g·L-1，檸檬酸鈉1 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，K2HPO44 g·L-1，KH2PO46 g·L-1,瓊脂粉20 g·L-1，pH 7.2，115 ℃滅菌20 min[8].

(2)細(xì)菌種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1, NaCl 10 g·L-1, pH 7.2，121 ℃滅菌20 min.

(3)細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基：D-木糖2 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，酵母膏2 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，NaCl 10 g·L-1, K2HPO41 g·L-1，pH 7.2，115 ℃滅菌20 min.

(4)放線菌初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g·L-1，KNO31 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1, K2HPO40.5 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 g·L-1，K2Cr2O70.03 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1，氨芐青霉素2 mg·L-1，121 ℃滅菌20 min.

(5)放線菌種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g·L-1,葡萄糖10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌15 min.

(6)放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿20 g·L-1，玉米粉10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，麩皮水解液配制，115 ℃滅菌30 min.

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

土樣進(jìn)行梯度稀釋，采用涂布平板法，接種在細(xì)菌初篩培養(yǎng)基平板上，對(duì)單菌落采用平板劃線分離法進(jìn)行純化[9-10].將純化的菌株逐個(gè)用細(xì)菌種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜，再按約10%的接種量(所有菌種保證菌液濃度一致，可按需適當(dāng)稀釋)接種至細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)24 h.接著用超聲波破壁法制備胞內(nèi)、胞外初酶液，采用改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定每個(gè)菌株的胞內(nèi)、胞外初酶液的活性大小，最終選出一個(gè)產(chǎn)酶活性最大的細(xì)菌菌株.

篩選放線菌菌株時(shí)與細(xì)菌的操作相似,土樣梯度稀釋液涂布在放線菌初篩培養(yǎng)基平板上，純化分離.再將菌株逐個(gè)接種至放線菌初篩培養(yǎng)基的試管斜面，培養(yǎng)至產(chǎn)孢穩(wěn)定期，接著制備濃度為107cfu·mL-1的孢子懸液，按1%接種量接種到放線菌種子培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h[7].將種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)移至放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)48 h.與細(xì)菌相同，制備胞內(nèi)、胞外初酶液，通過改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定酶活，選出一個(gè)產(chǎn)酶活性最大的放線菌菌株.

1.3.2 粗酶液的制備

發(fā)酵液于4000 r·min-1，10 min，4 ℃離心，收集上清即為胞外粗酶液.沉淀用三乙醇胺-鹽酸緩沖液(pH 8.0)-10 mmol·L-1MgSO4洗滌2次，再加入10倍沉淀體積的緩沖液-10 mmol·L-1MgSO4重懸菌體，超聲破碎.12000 r·min-1，20 min，4 ℃離心收集上清即為胞內(nèi)粗酶液[11].

1.3.3 酶活的測(cè)定

測(cè)定酶活采用改進(jìn)的硫酸咔唑法[11].250 μL 0.6 mol·L-1D-葡萄糖中加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的100 μL粗酶液、200 μL 0.025 mol·L-1三乙醇胺一鹽酸緩沖液，在70 ℃反應(yīng)15 min,再加入50%三氯乙酸50 μL終止反應(yīng)；立即加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的硫酸(冰浴冷卻)、100 μL質(zhì)量濃度為2.4 %的半胱氨酸-鹽酸鹽、100 μL質(zhì)量濃度為0.12%的乙醇-咔唑溶液.混勻后60 ℃反應(yīng)30 min，取出用流水冷卻；在可見分光光度計(jì)上，使用波長(zhǎng)為560 nm，以試劑空白為參比，光程為1 cm石英杯測(cè)其吸收度.

分別吸取50 μg·mL-1的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，按上實(shí)驗(yàn)方法依次加入硫酸、半胱氨酸鹽酸鹽、乙醇咔唑溶液，60 ℃顯色30 min，測(cè)定吸收度，繪制工作曲線.葡萄糖異構(gòu)酶酶活單位定義為：在上述方法的反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol果糖的酶量規(guī)定為1個(gè)活力單位(U).

1.3.4 菌落形態(tài)特征觀察與系統(tǒng)發(fā)育分析

菌體形態(tài)特征鑒定通過采用結(jié)晶紫和碘液先后染色，乙醇脫色，番紅復(fù)染的方法對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，采用高倍顯微鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)特征.

將純化的菌株振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，抽提基因組DNA.PCR擴(kuò)增菌體基因組16S rDNA.引物16S-F: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物16S-R: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′.PCR程序參考文獻(xiàn)[12]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)用瓊脂糖凝膠回收后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞.通過Blast程序，將由所測(cè)得的16S rDNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，選取同源性高的菌株后運(yùn)用ClustalX 2.1進(jìn)行比對(duì)分析,采用Mega 5.0程序，用 Neighbor-Joining算法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13].

1.3.5 酶活性質(zhì)初步研究

酶學(xué)性質(zhì)初步研究包括研究pH、溫度、金屬離子等對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶酶活力的影響[14].研究pH對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶酶活的影響：葡萄糖和粗酶液中加入200 μL的pH分別為7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0的緩沖液中，70 ℃反應(yīng)15 min，按改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定酶活[11].溫度對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶酶活的影響：調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)的溫度分別為60、65、70、75、80、85、90 ℃，緩沖液均為三乙醇胺一鹽酸緩沖液(pH 7.4)-10 mmol·L-1MgSO4，測(cè)定酶活.金屬離子對(duì)酶活力的影響：在最適溫度和pH條件下，向三乙醇胺-鹽酸緩沖液中分別添加終濃度為1 mmol·L-1Co2+, 5 mmol·L-1Mg2+, 1 mmol·L-1Ca2+, 1 mmol·L-1Mn2+, 1 mmol·L-1Fe3+，然后測(cè)定葡萄糖異構(gòu)酶活力.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選和發(fā)酵

對(duì)采集的21個(gè)土壤樣品進(jìn)行篩選, 得到28株細(xì)菌和35株放線菌,依次命名為XJ-1～XJ-28，F(xiàn)XJ-1～FXJ-35.其中XJ-27、FXJ-8的篩選平板見圖1a和圖1b.所有細(xì)菌、放線菌分別液體培養(yǎng)發(fā)酵后制備胞內(nèi)、外粗酶液.

圖1 XJ-27(a)和FXJ-8(b)初篩平板圖Fig.1 Preliminary screen plate diagram of XJ-27(a)and FXJ-8(b)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及酶活力測(cè)定

采用改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定28株細(xì)菌和35株放線菌的胞內(nèi)、外粗酶液,測(cè)定結(jié)果見表1和表2.結(jié)果顯示：細(xì)菌菌株XJ-27胞外酶活最高，為242.1 U·mL-1；放線菌菌株FXJ-8胞外酶活次之，為183.3 U·mL-1.

表1 28株細(xì)菌的胞內(nèi)、外酶活統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of intracellular and extracellular enzyme activities of 28 strains of bacteria

表2 35株放線菌的胞內(nèi)、外酶活統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of intracellular and extracellular enzyme activities of 35 strains of actinomyces

2.3 菌落形態(tài)特征觀察與系統(tǒng)發(fā)育分析

產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶胞外酶活最高的XJ-27細(xì)菌菌株在培養(yǎng)基上菌落表面突出，為不透明淡黃色、邊緣整齊，與培養(yǎng)基結(jié)合疏松，易挑取，見圖1a.經(jīng)革蘭氏染色確定該菌株為革蘭氏陽性菌，呈桿狀，有芽孢，見圖2.經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的序列比對(duì)分析，XJ-27的16S rDNA序列與Bacillus屬的16S rDNA序列均有99%的相似性，可鑒定該菌株為Bacillus屬細(xì)菌.菌株進(jìn)一步選取Bacillus屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明，XJ-27菌株與BacilluscoagulansATCC7050距離最近，同處一籌(圖3).因此，XJ-27菌株在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于: Bacteria，F(xiàn)imicutes，Bacillales，Bacillaceae，Bacillus.

圖2 菌株XJ-27的革蘭氏染色顯微圖(1000×)Fig.2 Gram staining micrograph of XJ-27(1000×)

圖3 菌株XJ-27的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree of XJ-27 based on 16S rDNA sequence

2.4 酶活性質(zhì)的測(cè)定

溫度和緩沖液條件不變，在不同pH條件下測(cè)定XJ-27胞外酶活.以pH 7.4下測(cè)得的酶活作為參照(記為100%),結(jié)果如圖4所示，該酶最適作用pH為7.0～7.8.pH和緩沖液條件不變，在不同溫度下測(cè)定XJ-27胞外酶活，以70 ℃下測(cè)得的酶活作為參照(記為100%)，結(jié)果如圖5所示，該酶最適溫度為70～80 ℃.不同離子下測(cè)定XJ-27胞外酶活，以含5mmol·L-1Mg2+緩沖液測(cè)得的酶活為參照(記為100%)，結(jié)果如圖6所示.XJ-27胞外酶活性依賴于Mg2+或Co2+.Ca2+、Mn2+、Fe3+金屬離子對(duì)酶活力無明顯的激活作用，Mg2+和Co2+有激活作用，Mg2+的效果最明顯.

圖4 XJ-27胞外酶的最適pHFig.4 Optimal pH of extracellular enzyme of XJ-27

圖5 XJ-27胞外酶的最適溫度Fig.5 Optimal temperature of extracellular enzyme of XJ-27

1)未加任何金屬離子; 2)1 mmol·L-1 Ca2+; 3)5 mmol·L-1 Mg2+;4) 1 mmol·L-1 Co2+ ; 5) 1 mmol·L-1 Mn2+; 6)1 mmol·L-1 Fe3+*表示與未加任何金屬離子相比，其酶活有顯著性差異，P<0.05圖6 金屬離子對(duì)XJ-27胞外酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ions on extracellular enzyme activity of XJ-27

3 討論

本文篩選產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶菌株時(shí)采用改進(jìn)的硫酸咔唑法測(cè)定酶活, 該法十分靈敏.測(cè)定時(shí)葡萄糖濃度及稀釋倍數(shù)很關(guān)鍵, 因?yàn)槠咸烟菨舛冗^高會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾.

細(xì)菌具有發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間短、所產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)的酶的適用范圍較廣等優(yōu)勢(shì).據(jù)報(bào)道，產(chǎn)細(xì)菌葡萄糖異構(gòu)酶菌種主要集中在凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)和節(jié)桿菌(ArthrobacterNRRL B3724)[8]，本研究篩選出的具最高胞外酶活的菌株XJ-27即為凝結(jié)芽孢桿菌.XJ-27酶活比張帆研究的大腸桿菌葡萄糖異構(gòu)酶酶活(41.1 U·mL-1)高5.8倍[15]，具有較強(qiáng)的應(yīng)用研究前景.

在HFCS生產(chǎn)過程中, 葡萄糖轉(zhuǎn)化率約為50%,而工業(yè)應(yīng)用要求果糖含量高于50%.由于葡萄糖異構(gòu)酶催化的葡萄糖異構(gòu)化為果糖的反應(yīng)為一可逆過程，在高溫條件下，此反應(yīng)的平衡偏向于果糖的生成[16-17].本文從土壤中篩選出的一株高產(chǎn)胞外葡萄糖異構(gòu)酶的細(xì)菌菌株XJ-27在pH 7.4時(shí)其最適反應(yīng)溫度為70～80 ℃.因此，進(jìn)一步提高其反應(yīng)溫度可增加果糖得率.提高酶的反應(yīng)溫度可從酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行研究，通過在分子中引入二硫鍵提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，是蛋白質(zhì)工程的常用方法[18-20].葡萄糖異構(gòu)酶的活性二聚體或四聚體解聚成亞基結(jié)構(gòu)可能是其熱不穩(wěn)定的重要原因之一.在亞基間構(gòu)建二硫鍵，增強(qiáng)亞基間的相互作用，也有可能改善酶的熱穩(wěn)定性.

酶的最適pH一般由酶活性中心部位的靜電環(huán)境，或者總的表面電荷所決定的，因此，改變酶作用的最適pH，可考慮通過改變靜電環(huán)境來實(shí)現(xiàn).對(duì)XJ-27菌株的葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)研究，可使蛋白質(zhì)工程方法定向改造葡萄糖異構(gòu)酶變得切實(shí)可行.