漆倩榮，羅金，王雅琴，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

近年來(lái)，囊胚移植已經(jīng)逐漸取代卵裂期胚胎移植，成為大部分生殖中心胚胎移植的主流方案。與卵裂期(D3)胚胎相比，囊胚移植可顯著提高IVF/ICSI-ET助孕患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[1-2]。但是如何進(jìn)一步提高囊胚的種植率與妊娠率，依然是生殖醫(yī)學(xué)學(xué)者密切關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。根據(jù)發(fā)育天數(shù)不同，囊胚多分為第5天(D5)囊胚和第6天(D6)囊胚。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者對(duì)新鮮周期和凍融周期D5與D6囊胚移植妊娠結(jié)局進(jìn)行了分析，但結(jié)果并不一致[3-6]。本研究回顧性分析了我中心2015年1月至2017年10月進(jìn)行囊胚移植的新鮮周期和凍融周期，比較D5和D6囊胚在新鮮周期和凍融移植周期中的妊娠結(jié)局，以期探索最佳的囊胚移植策略。

資料與方法

一、研究對(duì)象與分組

回顧性分析2015年1月至2017年10月在我院生殖中心行囊胚移植的患者資料。根據(jù)移植方案不同分為新鮮囊胚移植周期組(新鮮周期，256例)和凍融囊胚移植周期組(凍融周期，564例)。根據(jù)囊胚的發(fā)育天數(shù)不同，各組又分別分為D5囊胚組和D6囊胚組，其中新鮮周期中D5囊胚組157例，D6囊胚組99例；凍融周期中D5囊胚組350例，D6囊胚組214例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 在我中心行IVF/ICSI-ET助孕并行新鮮周期或凍融周期囊胚移植的患者；(2)女方年齡<42歲；(3)采用我中心標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案或拮抗劑方案進(jìn)行促排卵。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)同一凍融周期中同時(shí)移植D5和D6囊胚的患者；(2)有宮腔粘連等明確影響胚胎著床因素的患者。

二、治療方案

1.控制性促排卵、受精和胚胎培養(yǎng)：根據(jù)患者情況采用本中心標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案或拮抗劑方案促排卵，定期B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況并測(cè)定血清卵泡刺激素(FSH)、雌激素(E2)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)水平，調(diào)整促性腺激素(Gn)用量。適時(shí)給予HCG 5 000～10 000 U進(jìn)行扳機(jī)。36 h后在陰道超聲下取卵。根據(jù)男方精液參數(shù)行IVF或ICSI受精，IVF受精4 h后通過(guò)觀察極體排出情況決定是否需要行補(bǔ)救性ICSI。釆卵后第1天觀察卵母細(xì)胞受精情況。釆卵后第3天將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，第5天和第6天觀察囊胚形成情況并采用Gardner囊胚等級(jí)評(píng)分系統(tǒng)[7]進(jìn)行囊胚分期和評(píng)分。即根據(jù)囊胚腔擴(kuò)張程度分為1～6期，根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)細(xì)胞層(TE)細(xì)胞數(shù)分為A、B、C三個(gè)等級(jí)。選取正常受精的可利用囊胚(3期以上ICM/TE不同時(shí)為C級(jí))進(jìn)行移植或冷凍。根據(jù)ICM/TE評(píng)分將可利用囊胚再分為優(yōu)質(zhì)囊胚(ICM/TE評(píng)分為AA，AB或BA)、次優(yōu)囊胚(ICM/TE評(píng)分為BB)及低等級(jí)囊胚(ICM/TE評(píng)分有一項(xiàng)為C)。

2.囊胚冷凍復(fù)蘇與胚胎移植：新鮮周期根據(jù)囊胚發(fā)育天數(shù)在釆卵后第5天或第6天進(jìn)行移植。凍融周期中，所有的囊胚均采用玻璃化冷凍法進(jìn)行冷凍復(fù)蘇，具體操作方法見本中心已發(fā)表文獻(xiàn)[8]。擬行冷凍囊胚移植的患者，根據(jù)患者月經(jīng)周期情況采用人工周期或自然周期行內(nèi)膜準(zhǔn)備，分別于黃體酮轉(zhuǎn)內(nèi)膜或排卵后第5天進(jìn)行胚胎復(fù)蘇，培養(yǎng)2～4 h后移植。

3.移植后處理與隨訪：移植后給予每日黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)40 mg肌注及地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)20 mg口服進(jìn)行黃體支持。胚胎移植后14 d查血HCG，若為陽(yáng)性，則于移植后30～35 d行B超檢查觀察孕囊和胎心搏動(dòng)。移植后3個(gè)月電話隨訪是否有早孕流產(chǎn)或異位妊娠。

4.分析指標(biāo)：比較各組間患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、不孕原因、不孕類型；促排卵/內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目、胚胎質(zhì)量；臨床妊娠率、胚胎種植率、異位妊娠率和流產(chǎn)率等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組間患者一般情況比較

本研究共納入820個(gè)周期的患者資料，其中新鮮周期D5囊胚組157例，新鮮周期D6囊胚組99例，凍融周期D5囊胚組350例，凍融周期D6囊胚組214例。四組間患者年齡、不孕年限、BMI、不孕類型、不孕原因均無(wú)顯著性差異(P>0.5)；新鮮周期D5囊胚組和D6囊胚組促排卵方案無(wú)顯著性差異(P>0.5)；凍融周期D5囊胚組和D6囊胚組內(nèi)膜準(zhǔn)備方案差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.5)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、各組間患者實(shí)驗(yàn)室資料比較

四組患者間獲卵數(shù)、受精方式無(wú)顯著性差異(P>0.05)。盡管新鮮周期D6組中優(yōu)質(zhì)囊胚的比例低于其余3組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。無(wú)論是新鮮周期還是凍融周期，D5組平均移植胚胎數(shù)和雙囊胚移植率均顯著高于D6囊胚(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者實(shí)驗(yàn)室資料比較[(-±s)，n(%)]

三、新鮮周期與凍胚周期不同發(fā)育天數(shù)囊胚妊娠結(jié)局比較

新鮮周期中，D5囊胚的臨床妊娠率和種植率均顯著高于D6囊胚(P<0.001)，但凍融周期中D5與D6囊胚的臨床妊娠率和種植率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。此外，由于新鮮和凍融周期中D5組平均移植胚胎數(shù)和雙囊胚移植率較D6高，我們進(jìn)一步比較了單囊胚移植和雙囊胚移植在新鮮周期和凍融周期中的妊娠結(jié)局。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮周期中D6組單囊胚和雙囊胚移植的臨床妊娠率和種植率均顯著低于D5組(P<0.05)。但是在凍融周期中，無(wú)論是單囊胚移植還是雙囊胚移植，D5與D6組臨床妊娠率和種植率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。進(jìn)一步比較新鮮周期與凍融周期的妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)兩種周期D5組囊胚臨床妊娠率和種植率均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但是凍融周期D6組的臨床妊娠率和種植率顯著高于新鮮周期(P<0.05)。4組間早期妊娠丟失率和異位妊娠率均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 新鮮周期與凍胚周期不同發(fā)育天數(shù)囊胚妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

在IVF/ICSI-ET過(guò)程中，移植的胚胎根據(jù)體外培養(yǎng)時(shí)間的不同，可分為卵裂期胚胎和囊胚。囊胚經(jīng)過(guò)了體外初步淘汰過(guò)程，移植后較卵裂期胚胎妊娠率顯著提高[1-2]，且單囊胚移植在保證高妊娠率的前提下大大降低了多胎妊娠率[9]。近年來(lái)，囊胚移植在全世界范圍內(nèi)受到了廣泛的推廣和應(yīng)用。但是如何進(jìn)一步提高囊胚移植的妊娠結(jié)局，仍然是生殖學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

囊胚多在受精后第5天或第6天形成，因此根據(jù)發(fā)育天數(shù)不同，分為D5囊胚和D6囊胚。雖然已有不同學(xué)者對(duì)囊胚移植策略進(jìn)行了分析，但是所得結(jié)果并不盡一致。Poulsen等[3]研究認(rèn)為在新鮮周期中，D5囊胚比D6囊胚可以獲得更好的妊娠結(jié)局，作者將這一結(jié)果歸因于D6囊胚發(fā)育潛能受損。本研究結(jié)果與其一致，然而我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胚胎質(zhì)量沒有明顯差異時(shí)，將D6囊胚行凍胚移植可以得到與D5囊胚相似的妊娠結(jié)局，這一結(jié)果與El-Toukhy等[5]研究結(jié)果一致，提示新鮮周期中D6囊胚妊娠率下降可能與內(nèi)膜容受性有關(guān)。

眾所周知，胚胎植入僅能發(fā)生在月經(jīng)周期特定時(shí)期，即著床窗。子宮內(nèi)膜容受性受雌、孕激素的調(diào)節(jié)[10]。在IVF助孕過(guò)程中，由于超生理劑量的Gn使用、多卵泡的發(fā)育使子宮內(nèi)膜暴露于高雌激素環(huán)境，內(nèi)膜容受性顯著降低[11-12]。此外，在促排卵過(guò)程中，多采用大劑量HCG(5 000～10 000 U)模擬LH峰誘導(dǎo)卵子成熟。HCG在體內(nèi)的生物活性長(zhǎng)達(dá)5 d，可導(dǎo)致LH/HCG受體下調(diào)[13]。因此，子宮內(nèi)膜在接受態(tài)后期可能不能對(duì)囊胚的植入產(chǎn)生應(yīng)答。一項(xiàng)嚴(yán)格對(duì)照的研究比較了同一女性的非刺激周期黃體中期(LH+7)d和刺激周期黃體中期(HCG+7)d子宮內(nèi)膜胚胎植入相關(guān)因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示大多數(shù)與胚胎植入相關(guān)的基因(包括白血病抑制因子)在刺激周期中被下調(diào)[14]。另一項(xiàng)研究將傳統(tǒng)的HCG誘發(fā)排卵與采用GnRH激動(dòng)劑誘發(fā)排卵進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCG后7 d兩組子宮內(nèi)膜基因表達(dá)譜存在顯著差異[15]。這些數(shù)據(jù)表明，外源性和超生理劑量性激素可能會(huì)極大地影響子宮內(nèi)膜發(fā)育的時(shí)機(jī)，從而加速關(guān)閉子宮內(nèi)膜的植入窗口。

與新鮮周期相反，在冷凍胚胎移植周期中，子宮內(nèi)膜的最佳接受期更寬，更接近生理狀態(tài)[16-17]。在凍胚移植周期中，孕激素常用于子宮內(nèi)膜的分泌轉(zhuǎn)化使其具有接受性。最近的一項(xiàng)臨床RCT顯示在孕酮暴露第5天和第7天進(jìn)行冷凍囊胚移植的妊娠結(jié)局無(wú)顯著性差異[18]，提示在凍胚移植周期中，子宮內(nèi)膜對(duì)囊胚植入的應(yīng)答反應(yīng)至少可持續(xù)3 d。但是遺憾的是該項(xiàng)研究并未比較不同發(fā)育天數(shù)囊胚的妊娠結(jié)局。在本研究中，將D5或D6冷凍囊胚復(fù)蘇后都移植到孕激素暴露第5天的子宮內(nèi)膜，得到了相似的妊娠結(jié)局。提示凍融周期中，子宮內(nèi)膜的囊胚植入種植窗更加靈活，但也可能與種植窗的調(diào)整有關(guān)。

本研究對(duì)新鮮周期和凍融周期不同發(fā)育天數(shù)囊胚的妊娠結(jié)局的進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，D5囊胚在新鮮周期和凍融周期的妊娠結(jié)局并無(wú)顯著差異，但凍融周期D6囊胚臨床妊娠率和胚胎種植率顯著高于新鮮周期。但是印惠榮等[4]對(duì)新鮮周期與復(fù)蘇周期囊胚移植效果的比較研究認(rèn)為凍融周期囊胚移植比新鮮周期可獲得更好的妊娠結(jié)局，并且在復(fù)蘇周期中第5天移植者比第6天移植者效果更佳。值得注意的是，該項(xiàng)研究中作者在進(jìn)行新鮮周期和凍融周期妊娠結(jié)局比較時(shí)，并沒有對(duì)第5天和第6天囊胚進(jìn)行區(qū)分，我們有理由懷疑新鮮周期較凍融周期妊娠結(jié)局差可能是由于D6囊胚妊娠率低下所致。Zeng等[19]對(duì)新鮮周期和凍融周期單囊胚移植妊娠結(jié)局的Meta分析結(jié)果亦顯示，凍融單囊胚移植并不能比新鮮囊胚移植獲得更好的結(jié)局。陳培林等[20]對(duì)不同發(fā)育天數(shù)囊胚在凍融周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，認(rèn)為若移植胚胎為優(yōu)胚，則囊胚形成時(shí)間對(duì)于妊娠結(jié)局無(wú)顯著影響；但當(dāng)移植囊胚為非優(yōu)胚時(shí)，D5囊胚移植妊娠結(jié)局優(yōu)于D6囊胚。由于影響妊娠結(jié)局的因素眾多，如患者年齡、卵巢儲(chǔ)備功能、疾病構(gòu)成、宮腔環(huán)境、胚胎質(zhì)量等，大部分研究者觀察D5和D6囊胚的妊娠結(jié)局時(shí)未能同時(shí)對(duì)這些因素進(jìn)行比較，因此也導(dǎo)致了不同的研究者得出不同的結(jié)論。在本研究中，我們盡可能多的比較了各組間影響妊娠結(jié)局的相關(guān)因素，以消除這些因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的偏倚。但是由于本研究為基于臨床數(shù)據(jù)的回顧性研究，盡管D5囊胚組的平均移植胚胎數(shù)和雙胚胎移植率高于D6囊胚組，但是種植率的比較可以部分消除這一因素的影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不論新鮮周期還是凍融周期，雙囊胚移植的臨床妊娠率均高于單囊胚移植，但胚胎種植率低于單囊胚移植，這一結(jié)果為單囊胚移植的推廣應(yīng)用提供了一定的依據(jù)，但其發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究比較了新鮮周期和凍融周期D5囊胚和D6囊胚移植后的妊娠結(jié)局。結(jié)果表明，D5囊胚在新鮮周期和凍融周期移植的妊娠結(jié)局沒有顯著差異。新鮮周期中，D6囊胚移植比D5囊胚移植的臨床妊娠率和著床率更低，而凍融周期D6囊胚移植可達(dá)到與D5囊胚相似的結(jié)果，這可能與新鮮周期子宮內(nèi)膜種植窗提前關(guān)閉及凍融周期種植窗的調(diào)整有關(guān)。因此，建議D6形成的囊胚應(yīng)盡量避免新鮮周期移植，進(jìn)行冷凍保存后擇期行凍融胚胎移植可顯著改善妊娠結(jié)局。