胡晶晶 周偉 胡笑容

(1.鐘祥市人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 鐘祥 431900；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

心肌梗死后再灌注治療是治療心梗最有效的方法，而再灌注損傷很大程度地限制了再灌注治療的療效。心梗后自主神經(jīng)失衡，表現(xiàn)為交感神經(jīng)過度激活，迷走神經(jīng)活性相對減弱是加重心肌損傷和惡性心律失常的重要原因，而再灌注治療不能降低交感神經(jīng)活性。研究[1]證實(shí)，迷走神經(jīng)刺激可以通過增加迷走活性，相對抑制交感神經(jīng)活性減輕心肌缺血再灌注(ischemiaandreperfusion，IR)損傷。因此抑制交感活性可能是治療心肌缺血再灌注損傷的可靠手段。腎交感消融(renalsympathetic denervation,RSD)是降低心臟交感活性的有效方法[2]，與左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)消融為目前臨床研究最多的心交感神經(jīng)消融方法，二者均可治療高血壓和特定類型的室性心律失常，如兒茶酚胺敏感型室速。RSD與心肌損傷研究鮮有報道，前期的研究[3]證實(shí)，RSD可以顯著抑制心梗模型中心交感活性和心肌氧化應(yīng)激水平。本研究主要探討RSD對大鼠IR損傷的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組與動物模型建立 18只18～20周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于湖北省疾控中心。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為3組：假手術(shù)組，(SO組)：大鼠開腹暴露雙側(cè)腎臟，45 min后開胸、前降支下穿線不結(jié)扎；缺血再灌注組(IR組)：大鼠麻醉后開腹暴露雙側(cè)腎臟，45 min后開胸，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注4 h；RSD+IR組:大鼠麻醉后開腹，暴露雙側(cè)腎臟，行RSD，RSD成功后等待30 min開胸，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注4 h。

1.2RSD 暴露雙側(cè)腎臟后，剪斷腎門和腎動脈所有可見神經(jīng)纖維，為保證RSD效率，用棉簽蘸取10%乙醇苯酚溶液濕敷腎門和腎動脈15 min。

1.3建立動物模型 大鼠采用2%苯巴比妥鈉腹腔麻醉(45 mg/kg)，將大鼠仰臥位固定于恒溫板上，剔除頸部、胸部和內(nèi)側(cè)腹部毛發(fā)，在環(huán)狀軟骨下2節(jié)氣管插管(70 bpm，吸呼比1∶1.5，潮氣量1 mL)。沿腹部切口分離雙側(cè)腎臟，后沿左側(cè)胸部切口暴露心臟，剪開心包膜，在左心耳下2 mm處將LAD與中空帶凹槽的乳膠管結(jié)扎，結(jié)扎后遠(yuǎn)處心肌變白表明結(jié)扎成功，缺血30 min后，剪斷結(jié)扎線，再灌注4 h。

1.4ELisa 檢測血清肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)評價心肌損傷情況，檢測心肌組織間NE(interstitial norepinephrine，iNE)濃度，評價交感神經(jīng)活性。經(jīng)大鼠頸靜脈采血，離心(3 000 r×15 min)后取上清檢測。采用Elabscience公司試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。檢測范圍：CK-Mb：31.25～2000 pg/mL；cTnI：31.25～2000 pg/mL；iNE：0.31～20 ng/mL。

1.5生物化學(xué)檢測法 檢測缺血區(qū)心肌(梗死心肌周圍5 mm內(nèi))超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-Aoc)，評價心肌組織氧化應(yīng)激水平和抗氧化能力。選用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.6Western blot法 檢測缺血區(qū)心肌Beclin-1、LC3- Ⅱ評價心肌細(xì)胞自噬水平。勻漿后測定總蛋白濃度，每孔上樣量為40 μg，跑膠、轉(zhuǎn)膜后，與一抗(Beclin-1：1∶500稀釋，Abcam；LC3：1∶500稀釋，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)4℃孵育過夜，與相應(yīng)的二抗孵育后，ECL法顯色。

2 結(jié) 果

2.1心肌損傷 與SO組比較，IR組血清CK-Mb和cTnI表達(dá)均顯著增加。與IR組比較，RSD可以顯著降低血清CK-Mb和cTnI的表達(dá)。見表1。

表1 血清CK-Mb、cTnI及心肌組織iNE的表達(dá)

2.2心肌組織NE濃度 與SO組比較，IR組心肌組織中NE濃度顯著增加；與IR組比較，RSD組中NE濃度顯著降低。見表1。

2.3心肌氧化應(yīng)激水平 與SO組比較，IR組缺血區(qū)心肌組織氧化應(yīng)激水平(MDA)顯著增加，抗氧化能力(SOD，T-Aoc)顯著減弱；與IR組比較，RSD可以減輕缺血區(qū)心肌組織氧化應(yīng)激水平，增加抗氧化能力。見表2。

表2 心肌MDA表達(dá)以及SOD和T-Aoc活性

2.4心肌自噬水平 與SO組比較，IR組中Beclin-1表達(dá)水平(0.75±0.11 VS 0.18±0.024，P<0.05)和LC3-Ⅱ(0.32±0.048 VS 0.087±0.0068,P<0.05)顯著增加；與IR組比較，RSD可以顯著抑制Beclin-1的表達(dá)(0.47±0.051，P<0.05)和LC3- Ⅱ(0.21±0.032，P<0.05)的表達(dá)。見圖1，表3。

圖1 Beclin-1和LC3-Ⅱ相對表達(dá)量

表3 心肌組織Beclin-1和LC3-Ⅱ相對表達(dá)

3 討 論

RSD為心交感消融的有效方法，前期大量研究[4-5]表明，RSD可以通過抑制心交感過度激活降低患者血壓以及缺血后房性、室性心律失常以及心衰的發(fā)生。RSD可以通過下丘腦室旁核，延髓頭端腹外側(cè)，雙側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)支配心臟交感活性。我們前期研究證實(shí)，RSD可以顯著抑制心梗后左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)活性，即心交感活性，抑制室性心律失常的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，RSD可以顯著抑制心肌組織NE水平，進(jìn)一步印證了RSD為心交感消融的有效方法，可以顯著抑制IR中心交感過度激活。

交感過度激活是加重心肌IR損傷的重要因素，前期B.Buchholz等[6]研究證實(shí)，通過長時間低強(qiáng)度迷走神經(jīng)刺激可以激活交感神經(jīng)，進(jìn)而加重心肌IR損傷，而這種作用可以完全被倍他樂克阻斷。組織中過高濃度的NE也是加劇IR損傷的重要因素，血清中NE濃度的過高也提示了不良預(yù)后[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)RSD可以顯著抑制心肌IR損傷，降低組織NE濃度，因此我們推測，RSD可以通過抑制交感活性和NE濃度減輕心肌IR損傷

心肌缺血時，氧供中斷、ATP耗竭，為保證機(jī)體所需，交感激活，增加心肌收縮力和心率，進(jìn)一步加劇耗氧，導(dǎo)致心肌抗氧化能力耗竭，再灌注時富氧血流再通，引起局部心肌氧化/抗氧化失衡，氧化應(yīng)激水平激增。過高的氧化應(yīng)激水平可以持續(xù)開放線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，誘導(dǎo)線粒體腫脹破裂，呼吸鏈中活性氧大量釋放，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激。有研究表明，離斷交感神經(jīng)可以減輕肝臟IR中氧化應(yīng)激水平[9]。NE可以通過NADPH途徑誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生活性氧[10]。RSD減輕腦中氧化應(yīng)激水平[11]，腎盂積水模型中，腎臟的氧化應(yīng)激水平[12]。結(jié)合本研究結(jié)果我們推測，RSD可以通過抑制交感過度激活和組織中NE表達(dá)減輕大鼠心肌氧化應(yīng)激水平，增加抗氧化能力。

自噬是心肌IR損傷的重要機(jī)制，目前普遍認(rèn)為在缺血期自噬可以清除受損蛋白和細(xì)胞器，促進(jìn)細(xì)胞存活，為保護(hù)機(jī)制，而再灌注時，由于自噬過度激活，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為損傷機(jī)制。自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，其中巨自噬為自噬的主要形式，損傷的細(xì)胞器或者大分子蛋白被雙層質(zhì)膜包裹形成自噬小體，與溶酶體結(jié)合降解。目前認(rèn)為VPS34-VPS15-Beclin-1復(fù)合物是激活自噬小體形成的關(guān)鍵酶復(fù)合物，其參與了磷脂酰肌醇(PI)磷酸化形成PI3P，而PI3P為形成自噬小體的必需物質(zhì)。LC3-Ⅱ泛素化復(fù)合物是自噬小體形成的另一個重要介質(zhì)，LC3-Ⅱ分布在自噬小體上，與溶酶體結(jié)合后降解，因此LC3-Ⅱ反應(yīng)了自噬的水平。本研究發(fā)現(xiàn)RSD可以顯著抑制心肌組織Beclin-1的表達(dá)，降低LC3-Ⅱ的表達(dá)即抑制細(xì)胞巨自噬的水平。氧化應(yīng)激可以通過多種途徑調(diào)節(jié)自噬水平，研究表明，過量活性氧可以通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路、激活A(yù)MPK通路、抑制Atg活性等引起細(xì)胞內(nèi)Beclin-1和LC3-Ⅱ的聚集，激活自噬[13]。因此我們推測RSD可以通過抑制氧化應(yīng)激減輕心肌自噬水平。

綜上所述，RSD為心臟交感神經(jīng)消融的有效方法； RSD可以通過抑制交感神經(jīng)活性減輕大鼠心肌氧化應(yīng)激和自噬水平，進(jìn)而減輕大鼠心肌IR損傷； RSD減輕大鼠心肌自噬可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。