劉尹 郭倫鋒 鄭龍

(安康市中心醫(yī)院藥劑科，陜西 安康 725000)

川芎(LigusticumchuanxiongHort.)是傘形科藁本屬多年草本植物干燥的根莖[1]，主要生長(zhǎng)在四川的彭州和都江堰等地區(qū)的道地藥材。川芎性溫，味辛；歸肝、心、膽經(jīng)，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，川芎是祛風(fēng)止痛、活血行氣的良藥，川芎主要藥效成分包括阿魏酸、總生物堿、揮發(fā)油和酚性成分等物質(zhì)[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[4-5]表明，川芎具有擴(kuò)張冠脈血管，延緩?fù)庵軇?dòng)脈血管緊張，改善腦部部位循環(huán)，保護(hù)腦缺血損傷，抑制血小板聚集及抗血栓形成，抗氧化等藥理作用。指紋圖譜分析是對(duì)中藥或天然藥物質(zhì)量的一種整體表達(dá)方式，能客觀的體現(xiàn)中藥的復(fù)雜性和整體性[6-7]。本實(shí)驗(yàn)所建立的UPLC指紋圖譜鑒別方法，可操作性強(qiáng)，簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，為有效、客觀的評(píng)價(jià)川芎藥材質(zhì)量提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 (1)儀器：島津LC-20ADXR型高效液相色譜儀，配備包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器(PDA)(島津公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP210S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。(2)試劑：阿魏酸(批號(hào)為110807-201306，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)，洋川芎內(nèi)脂Ⅰ(批號(hào)為150213，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蒿本內(nèi)酯(批號(hào)為MUST-11072416，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。15批川芎藥材來(lái)源于四川成都、彭山、湖北、浙江、云南等地，藥材處理方法按照2015版藥典要求切片，曬干，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，備用。

1.2方法

1.2.1色譜條件 Accucore TC-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，梯度程序?yàn)椋? min：5% A，2 min：10% A，25 min：40% A，30 min：60% A，35 min：90% A，45 min：5% A，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫35°C。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸、洋川芎內(nèi)脂Ⅰ、蒿本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加入70%甲醇，搖勻制成混合對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液制備 取川芎粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精

密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2 結(jié) 果

2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將空白試劑(甲醇)、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“1.2.1項(xiàng)下”的色譜條件分別進(jìn)樣分析。對(duì)比三個(gè)色譜圖，如圖1所示。結(jié)果顯示各成分相互之間均無(wú)明顯干擾，分離度符合測(cè)定要求，且空白試劑也無(wú)干擾峰存在。

注：1.阿魏酸；2.洋川芎內(nèi)脂I；3.蒿本內(nèi)酯圖1 空白溶液、混標(biāo)、供試品UPLC色譜圖

2.2精密度試驗(yàn) 將同一種供試品溶液，按“1.2.1項(xiàng)下”的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣2 μL，測(cè)定主要色譜峰的峰面積分值。計(jì)算參考峰面積RSD值，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.56%～2.57%，表明精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，按“1.2.1項(xiàng)下”的色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μL，測(cè)定主要色譜峰的峰面積分值。計(jì)算參考峰面積RSD值，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.83%～1.24%。表明混合對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4重復(fù)性考察 按照“1.2.3項(xiàng)下”供試品溶液制備的方法平行制備6份供試品溶液，分別按上述色譜條件，進(jìn)樣量2 μL，測(cè)定主要色譜峰的峰面積分值。計(jì)算參考峰面積RSD值，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為1.55%～3.73%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5指紋圖譜的建立 按“1.2.3項(xiàng)下”供試品制備方法制備15個(gè)不同產(chǎn)地川芎藥材的供試品溶液，取供試品溶液各進(jìn)樣2 μL，以阿魏酸峰(2號(hào))為參照物峰，理論板數(shù)不低于8 000。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，將15批樣品測(cè)定數(shù)據(jù)以AIA格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A)，采用相對(duì)保留時(shí)間作為唯一指標(biāo)，利用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)置值為0.1，多點(diǎn)校正后進(jìn)行峰自動(dòng)匹配，計(jì)算生成對(duì)照譜圖R，生成的對(duì)照?qǐng)D譜和峰自動(dòng)匹配后所有樣品的UPLC指紋圖譜如圖2所示，再進(jìn)行共有峰標(biāo)定，最終標(biāo)定了共有峰15個(gè)，編號(hào)為 S1～S15。 各特征峰相對(duì)穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性。以2號(hào)峰(阿魏酸)作為參照峰，標(biāo)定15個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD 在0.03%～0.68%，經(jīng)混合對(duì)照品溶液譜圖對(duì)比，確認(rèn)了3個(gè)主要特征峰，分別是2號(hào)峰(阿魏酸)，3號(hào)峰(洋川芎內(nèi)脂I)；11號(hào)峰(蒿本內(nèi)酯)。

注：S1-S15.15批樣品UPLC圖；R.對(duì)照色譜圖；2.阿魏酸；3.洋川芎內(nèi)脂I；11.蒿本內(nèi)酯圖2 15批川芎樣品色譜分析圖

2.6川芎指紋圖譜的評(píng)價(jià) 依照指紋圖譜整體性、相似性的特征，對(duì)生成的指紋圖譜進(jìn)行指標(biāo)評(píng)價(jià)，對(duì)15批不同產(chǎn)地川芎的指紋圖譜(S1～S15)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果，檢測(cè)的相似度值均高于0.957，川芎藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15批川芎藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.73個(gè)指標(biāo)成分峰面積值分析 以樣品編號(hào)為橫坐標(biāo)，以阿魏酸、洋川芎內(nèi)脂Ⅰ、蒿本內(nèi)酯3 個(gè)峰總峰面積值為縱坐標(biāo)，得出 15 批川芎 3 個(gè)共有峰總峰面積值曲線圖，如圖3所示。結(jié)果表明云南、四川、浙江產(chǎn)地的(S4～S8) 3個(gè)共有峰峰面積總值在所有樣品中最大，總體含量最高，而彭山、漢中、成都(S9～S15)3個(gè)共有峰峰面積總值最小，總體含量最低，其中彭州、彭山、成都(S1～S3、S9～S11、S13～S15)三個(gè)產(chǎn)地組的組內(nèi)的三個(gè)藥材的3個(gè)共有峰峰面積接近，總體含量接近，同時(shí)表明來(lái)源于同一產(chǎn)地的川芎中的成分含量相近。綜合含量分析結(jié)果可知，同產(chǎn)于四川的川芎，含量也有較為明顯的差異，表明產(chǎn)地對(duì)川芎質(zhì)量影響較大。

圖3 15批川芎阿魏酸、洋川芎內(nèi)脂Ⅰ、蒿本內(nèi)酯總峰面積值曲線圖

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以PAD檢測(cè)器對(duì)不同的川芎樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，大部分共有峰成分在280 nm波長(zhǎng)下有較好吸收，且基線平穩(wěn)，峰高度較好，峰形較佳，因此確定280 nm為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。試驗(yàn)考察了甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、分別作為流動(dòng)相系統(tǒng)，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫，各色譜峰的峰形較好，能達(dá)到基線分離。考察了1、2、4、5 μL等不同樣品進(jìn)樣量，考察25°C、30°C、35°C、等不同柱溫，以及0.1 mL/min、0.2 mL/min、0.3 mL/min、0.5 mL/min等不同流速。綜合考慮其他目標(biāo)峰的情況，最終選定的檢測(cè)條件為：乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2μL，柱溫35°C為較適宜色譜條件。對(duì)比超聲法和加熱回流法提取下的色譜圖，確定“1.2.3”項(xiàng)下的提取方法。

目前，在現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中大多采用對(duì)川芎有效成分含量測(cè)定，片面的以含量的高低，進(jìn)行川芎質(zhì)量評(píng)價(jià)，但這種單一的方式難以反映中藥整體質(zhì)量[8]。本實(shí)驗(yàn)所建立川芎檢測(cè)和分析方法可以有效的評(píng)價(jià)藥材內(nèi)在品質(zhì)和差異性，同時(shí)又能為含量檢測(cè)方法提供一定的支撐，綜合結(jié)果表明本研究建立的川芎指紋圖譜重復(fù)性好，方法可行，可作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。