宋彬彬，陳崢，賈炳泉，李鳳囡，朱文藝，楊璇，陳艷清，于佳

微管是由13條原纖維構(gòu)成的直徑約25 nm的空心管狀結(jié)構(gòu)，每條原纖維由α-和β-微管蛋白（tubulin）二聚體線性排列而成。微管兩端具有極性，正端最末端是β-tubulin，聚合速度快，處于動態(tài)的聚合和解聚的轉(zhuǎn)換狀態(tài)，使微管正端快速伸長或縮短，即微管的動態(tài)不穩(wěn)定性；負端集中于近核區(qū)的微管組織中心，最末端是α-tubulin，聚合速度慢，較穩(wěn)定[1]。微管散布于胞質(zhì)中，起到細胞骨架的支撐和軸突運輸?shù)能壍雷饔谩Ｉ窠?jīng)元具有軸突和樹突分支，其中運動神經(jīng)元體積較大，軸突較長，對微管依賴的蛋白質(zhì)、亞細胞器和營養(yǎng)因子等長距離運輸需求尤甚。肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是最常見的運動神經(jīng)元病，微管結(jié)構(gòu)和功能的異常變化與疾病發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[2]。本文就微管組成和調(diào)控相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、ALS中微管異常的原因及微管異常引起運動神經(jīng)元變性死亡的可能機制進行綜述。

1 微管組成和調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 微管正端示蹤蛋白（plus-end tracking proteins，+TIPs）

末端結(jié)合蛋白（end-binding proteins，EBs）是位于微管正端重要的結(jié)合蛋白，哺乳動物細胞中主要有EB1、EB2和EB3亞型。EBs蛋白N端的CH（calponin homology）結(jié)構(gòu)域具有微管親和能力，介導(dǎo)其與微管的結(jié)合；C端的卷曲螺旋區(qū)域負責(zé)EBs單體的二聚化，也可與其他具有CAP-Gly和SxIP（serine/threonine any amino acid isoleucine/leucine proline）修飾的+TIPs相互作用；保守的EB同源結(jié)構(gòu)域（end binding homology domain，EBH）與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域部分重疊；C端最末區(qū)域為高度保守的EEY/F基序。EBs主要作為微管正端的支架蛋白位于+TIPs的中心，為蛋白質(zhì)的結(jié)合提供平臺，有效形成和維持微管正端的完整性和功能[1,3]。根據(jù)+TIPs與EBs的結(jié)合，可將+TIPs分為3類：CAP-Gly蛋白、SxIP蛋白及EBs非依賴型蛋白。

CAP-Gly蛋白主要包括細胞質(zhì)連接蛋白（cytoplasmic linker protein，CLIPs）和 p150glued：①CLIP170是神經(jīng)元中主要的+TIPs，其N端具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域，可與EB1和α-tubulin的C端EEY/F基序結(jié)合；C端具有鋅結(jié)合域和EEY/F基序，可與具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域的+TIPs相結(jié)合[4]；②p150glued是由DCTN1基因編碼的，動力蛋白激活蛋白dynactin最大亞基。p150glued的N端具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域，可與含有EEY/F基序的α-tubulin以及EB1和CLIP170直接結(jié)合；CC1結(jié)構(gòu)域可與動力蛋白dynein的中鏈結(jié)合。EB1、CLIP170與p150glued相互作用可以抑制微管正端崩解[5]。

SxIP蛋白是+TIPs最多的類型。CLASP1/2、APC2、MACF1/2等具有SxIP修飾的蛋白與EBs結(jié)合定位在微管正端，可以捕獲動態(tài)的微管末端，調(diào)控微管運動或靜止，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化、發(fā)育和軸突運輸功能[1]。

+TIPs中也有dynein、kinesin、XMAP215/DIS1和LIS1等EBs非依賴型蛋白：①動力蛋白dynein的重鏈和部分驅(qū)動蛋白kinesin的重鏈具有微管結(jié)合區(qū)域，與微管直接結(jié)合，調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)和貨物沿微管的運輸[6]；②XMAP215/DIS1家族蛋白為微管聚合酶，通過其N端的TOG結(jié)構(gòu)域定位于微管正端，可招募tubulin二聚體到微管的生長端，提高微管組裝和聚合速度；③LIS1蛋白N端具有LIS同源蛋白結(jié)構(gòu)域，C端具有WD40重復(fù)序列，通過WD40主要與dynein相互作用定位在微管正端，活化dynein[4]。

1.2 微管負端示蹤蛋白

大部分γ-tubulin可在微管負端形成γ-tubulin環(huán)狀復(fù)合體，具有微管成核活性，調(diào)控微管的組裝[7]。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)CAMSAPs（calmodulin-regulated spectrin-associated proteins）家族蛋白 CAMSAP1、CAMSAP2和CAMSAP3是獨立于γ-tubulin的微管負端蛋白。不同亞型的CAMSAPs可特異性抑制微管負端的聚合或崩解，調(diào)節(jié)微管負端生長速度[8]。

1.3 微管結(jié)合蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）

MAPs是附著在微管多聚體上，參與微管組裝，決定微管網(wǎng)絡(luò)三維結(jié)構(gòu)，并可作為微管與其他蛋白質(zhì)相連的橋梁。MAPs主要分為3類：①MAP1A/MAP1B。MAP1與微管結(jié)合能力較弱，其C端與tubulin結(jié)合，N端可與其他細胞骨架或質(zhì)膜連接，調(diào)控微管的空間分布。②tau、MAP2和MAP4。tau和MAP2主要定位于微管不穩(wěn)定區(qū)域（易被秋水仙素解聚的區(qū)域）的微管晶格內(nèi)，增強微管蛋白間連接，抑制微管解聚，促進微管成束[9]。MAP4可正調(diào)節(jié)微管的動態(tài)不穩(wěn)定性[10]；③其他類型如MAP6。MAP6與微管結(jié)合可以抵抗低溫引起的微管解聚[11]。

1.4 微管切割蛋白

細胞中最常見的微管切割蛋白是katanin和spastin，二者為微管剪切ATP酶，可結(jié)合在微管穩(wěn)定區(qū)，在微管表面形成六聚體，從微管晶格中快速提取tubulin，使微管斷裂，調(diào)節(jié)微管長度和數(shù)量。大鼠海馬神經(jīng)元中katanin或spastin表達水平提高可增加較短微管數(shù)量，微管正端組裝活躍，軸突分支增多[12]。

1.5 tubulin翻譯后修飾

最初發(fā)現(xiàn)tubulin乙?；l(fā)生于α-tubulin的第40位賴氨酸，即K40位點。tubulin乙?；接梢阴＾D(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶HDAC6（histone deacetylase 6）和SIR2（sirtuin2）活性調(diào)節(jié)。Kiesin-1或dynein主要與乙酰化的α-tubulin結(jié)合，促進雙向運輸[13]。PC-12細胞中微管穩(wěn)定性與乙?；⒐艿鞍姿匠收嚓P(guān)[14]。

大部分細胞中α-tubulin發(fā)生酪氨酸化/去酪氨酸化循環(huán)。微管蛋白羧肽酶可以特異性去除α-tubulin C端尾部EEY/F基序中酪氨酸（Tyr），暴露出相鄰氨基酸殘基谷氨酸（Glu）殘基，形成Glu-MT，即去酪氨酸化。TTL（tubulin-tyrosine ligase）可以催化其逆反應(yīng)，減少Glu-MT的形成[15]。CLIP170與Glu-MT結(jié)合能力較弱，酪氨酸化α-tubulin富集于微管不穩(wěn)定區(qū)，可招募p150Glued和CLIP170等具有CAP-Gly結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與微管正端結(jié)合[16]。

tubulin具有磷酸化位點。周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinases，CDK1）可使β-tubulin的S172位點磷酸化，在細胞分裂過程中調(diào)節(jié)微管動力學(xué)。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）可使α-tubulin羧基端磷酸化，具體位點仍未明確。磷酸化的tubulin與MAPs結(jié)合能力改變[17]。

多聚甘氨?；投嗑酃劝滨；l(fā)生于tubulin羧基端。多聚甘氨?；窃趖ubulin羧基端谷氨酸位點在甘氨酸連接酶的作用下與長鏈甘氨酸修飾相連。而多聚谷氨?；窃趖ubulin羧基端谷氨酸位點在tubulin酪氨酸連接酶的作用下與長鏈谷氨酸修飾相連，發(fā)生于神經(jīng)元的大部分微管。多聚谷氨酰胺化tubulin更易與MAPs相結(jié)合[18]。

2 ALS中的微管異常

ALS是主要累及大腦、皮質(zhì)和脊髓運動神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病，分為家族性ALS（familial ALS，fALS）和散發(fā)性ALS（sporadic ALS，sALS）。其受損運動神經(jīng)元中發(fā)生微管組成和調(diào)控相關(guān)蛋白表達水平改變、軸突形態(tài)或運輸障礙，提示微管結(jié)構(gòu)和功能異常。

2.1 超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）

fALS患者中約20%為SOD1突變。SOD1G93AALS小鼠模型中運動神經(jīng)元中微管動態(tài)不穩(wěn)定性增強，tau和MAP2積累[19]；SOD1G93A小鼠出生后120 d脊髓中去HDAC6蛋白及其mRNA水平顯著下降[20]。SOD1G93AALS小鼠出生早期（50～70 d），運動神經(jīng)元軸突完整性出現(xiàn)損傷，而提高乙?；痶ubulin水平可以在ALS早期維持運動神經(jīng)元軸突的完整性，減少軸突變性[21]，增加NMJ對腓腸肌的神經(jīng)支配功能，神經(jīng)元數(shù)目有所提高，延長ALS小鼠生存期[22]。Tateno等[23]研究發(fā)現(xiàn)SOD1G93A小鼠模型脊髓運動神經(jīng)元和過表達SOD1G85R NG108-15細胞中，SOD1錯誤積聚招募貨物接頭蛋白kinesin亞基KAP3，使KAP3功能受損，引起貨物蛋白ChAT運輸障礙；過表達SOD1G85R的NG108-15細胞中，加入秋水仙素處理可加劇ChAT運輸障礙。SOD1G37RALS小鼠模型脊髓組織中，CDK5活性增強，使tau高度磷酸化[24]。且乙?；痶ubulin水平增齡性改變：4月齡SOD1G37R小鼠模型的脊髓中SIRT1（SIR2同源蛋白）水平輕微增加；10-12月齡ALS小鼠脊髓中SIRT1水平顯著上調(diào)[25]。果蠅中過表達SOD1A4V和tau可使磷酸化tau水平顯著增加，毒性增強。COS-7細胞中過表達SOD1A4V可提高不溶性tubulin水平。體外研究發(fā)現(xiàn)突變的SOD1可抑制tubulin的聚合[26]。

2.2 TAR DNA結(jié)合蛋白 43（transactivating response DNA binding protein 43，TDP-43）和肉瘤融合蛋白（fused in sarcoma，F(xiàn)US）

TDP-43和FUS是fALS致病基因，可參與調(diào)控RNA剪切、穩(wěn)定性、運輸和表達等。ALS中突變型TDP-43和FUS核輸入信號受損，可錯位形成胞質(zhì)不溶性包涵體[27]。TDP-43突變或表達下降會損傷其調(diào)控RNA結(jié)合和剪切功能，可能改變MAPs表達水平，從而影響微管結(jié)構(gòu)和功能[2]。果蠅神經(jīng)元中敲減TDP-43會上調(diào)Map205（哺乳動物MAP4同源蛋白）水平[28]；減弱線粒體雙向軸突運輸[29]。HEK293細胞中敲減TDP-43使HDAC6 mRNA和蛋白水平下降[30]。果蠅運動神經(jīng)元中過表達TDP-43WT和TDP-43G298S可以改變Futsch mRNA的運輸和翻譯，NMJ中Futsch蛋白水平顯著下降；NMJ突觸終扣數(shù)量明顯減少，突觸終扣中Futsch陽性的環(huán)狀微管減少，乙?；痶ubulin水平顯著下降；過表達Futsch增加微管穩(wěn)定性可提高終扣數(shù)量[31]。NIH/3T3細胞中過表達TDP-43A315T可減少去酪氨酸化tubulin水平[15]。

NIH/3T3細胞中過表達ALS致病型FUS突變產(chǎn)生的FUS包涵體也可使去酪氨酸化tubulin水平下降。過表達kinesin-1或抑制FUS包涵體的產(chǎn)生會緩解FUS突變引起的去酪氨酸化tubulin水平的下降[15]。Guo等[32]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)USR521H和FUSP525L患者多能干細胞衍生的運動神經(jīng)元中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡軸突運輸受損，運動的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡數(shù)量進行性下降；線粒體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria-associated ER membranes，MAMs）結(jié)構(gòu)域受損，提示細胞骨架發(fā)生變化。抑制HDAC6的表達提高乙酰化tubulin水平會緩解FUS突變引起的軸突運輸障礙。

2.3 動力蛋白激活蛋白1（dynactin1，DCTN1）

ALS中p150glued CAP-Gly結(jié)構(gòu)域突變或缺失使p150glued與微管蛋白結(jié)合能力顯著下降；與EB1、CLIP170相互作用減弱。而且p150glued G59S突變會阻礙CAP-Gly結(jié)構(gòu)域的折疊，使p150glued在胞質(zhì)異常積聚，微管重新聚合能力下降[33]。本課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，9月齡運動神經(jīng)元中p150glued缺失小鼠模型的脊髓組織中乙?；?tubulin水平顯著增加，18月齡時小鼠腓腸肌神經(jīng)肌肉接頭碎裂，去神經(jīng)支配[34]。Hela細胞中敲減p150glued后溶酶體定位分散，自噬體與溶酶體共定位減少，提示p150glued水平下降可能引起溶酶體或自噬體運輸障礙，使二者融合受阻[35]。p150gluedG59S小鼠模型的脊髓運動神經(jīng)元胞體和軸突腫脹，部分有髓鞘的軸突發(fā)生沃勒變性[36]。果蠅神經(jīng)元中過表達p150gluedG59S可使軸突遠端突觸終扣數(shù)量和體積增加，致密核心囊泡（dense core vesicle，DCV）和內(nèi)體積累[37]。

2.4 囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白B（vesicle associated membrane protein associated protein B，VAPB）

VAPB突變可以引起fALS，也稱ALS8。小鼠海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)VAPB與微管存在相互作用，其可在單根微管上出現(xiàn)聚集[38]。果蠅神經(jīng)元中過表達DVAPV260I（人中ALS致病突變VAPBV234I）可使神經(jīng)肌肉接頭突觸終扣數(shù)量增加，體積減小，形態(tài)改變，且突觸終扣中Futsh（MAP1B同源蛋白）陽性的環(huán)狀微管比例增加[39]。HEK293細胞中過表達VAPBP56S可使tubulin與線粒體外膜蛋白Miro-1的結(jié)合減少，破壞線粒體正向運輸[40]。

2.5 肌萎縮側(cè)索硬化蛋白2（ALS2）

ALS2基因突變或功能缺失與青少年型ALS發(fā)生有關(guān)。Gros-Louis等[41]研究發(fā)現(xiàn)ALS2缺失小鼠模型130 d時，坐骨神經(jīng)中tubulin水平增齡性顯著增加，且tubulin相關(guān)的軸突運輸受阻。Devon等[42]發(fā)現(xiàn)ALS2缺失小鼠12月齡時，皮質(zhì)運動神經(jīng)元胞體和軸突直徑變小，內(nèi)體融合和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrKB運輸受損，提示微管的細胞骨架功能和運輸功能發(fā)生異常。

2.6 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF為神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以促進神經(jīng)元存活和突起延伸，而ALS患者和SOD1G93A小鼠模型中VEGF蛋白和mRNA水平下降[43]。VEGF delta/delta小鼠模型神經(jīng)元中VEGF表達水平下降，5月齡時出現(xiàn)運動功能障礙等ALS癥狀，且脊髓運動神經(jīng)元中tubulin、tau、MAP1b和MAP6等基因水平下降[44]。ALS小鼠運動神經(jīng)元中過表達VEGF可通過激活PI3K/Akt通路減輕SOD1G93A的神經(jīng)毒性[45]，提示VEGF突變可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)tubulin或MAPs表達，但其具體機制有待深入研究。

2.7 微管蛋白4α（TUBA4A）

TUBA4A（α-tubulin亞型）廣泛表達于所有細胞類型，且在神經(jīng)系統(tǒng)中表達最高，TUBA4A可與β-tubulin、kinesin和MAPs相互作用，調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)和功能。fALS患者中存在TUBA4A突變，造成運動神經(jīng)元損傷[46]。COS7細胞中過表達TUBA4AR320C會減弱微管重組能力。原代運動神經(jīng)元中過表達突變型TUBA4A引起乙?；?tubulin水平顯著下降；TUBA4A突變型與β-tubulin共定位減弱，提示TUBA4A突變型可能由于功能缺失引起微管異常[47]。

2.8 spastin突變

Tremolizzo等[48]研究發(fā)現(xiàn)了ALS新型致病突變：50歲意大利女患者出現(xiàn)進行性肢體力量缺陷，重復(fù)跌倒的ALS臨床癥狀，脊髓運動神經(jīng)元數(shù)量減少?；驒z測發(fā)現(xiàn)該患者存在微管切割蛋白spastin c.194G＞A突變，可能破壞spastin功能而引起微管異常。

2.9 sALS

sALS患者皮質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)高度磷酸化和不溶性tau蛋白沉積，且活化的糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3，GSK3β）與tau共定位，提示tau蛋白的磷酸化可能是由GSK3β活性增強引起[49]；脊髓運動神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)α-tubulin基因水平下降[50]。

3 微管異常參與運動神經(jīng)元變性死亡的可能機制

微管是神經(jīng)元調(diào)節(jié)細胞形態(tài)和軸突運輸主要結(jié)構(gòu)，運動神經(jīng)元對微管損傷更為敏感[51]。研究發(fā)現(xiàn)，軸突運輸受損是ALS的早期癥狀[23]，可能參與運動神經(jīng)元變性死亡。

3.1 線粒體運輸障礙

線粒體可經(jīng)雙向軸突運輸分布于神經(jīng)元胞體和突起，是細胞產(chǎn)生能量的主要場所，而軸突遠端的生長錐和突觸區(qū)域?qū)δ芰啃枨蟾黠@。ALS中線粒體運輸異常導(dǎo)致其錯誤定位可引起神經(jīng)元局部能量缺陷或鈣離子水平異常，產(chǎn)生損傷[52]。

3.2 蛋白質(zhì)降解障礙

自噬是細胞降解錯誤積聚蛋白質(zhì)的主要途徑。ALS中微管異常會減弱自噬體的逆向軸突運輸，阻礙錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解，產(chǎn)生毒性引起細胞變性死亡。研究發(fā)現(xiàn)，原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中誘導(dǎo)自噬會明顯抑制TDP-43突變積聚體引起的細胞死亡[53]。線蟲運動神經(jīng)元中使用HDAC抑制劑TSA可以提高微管穩(wěn)定性，恢復(fù)軸突運輸受損引起的自噬障礙[54]。

3.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子運輸障礙

神經(jīng)營養(yǎng)因子通常是由神經(jīng)所支配的組織或膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的，進入神經(jīng)末梢后與其受體（TrkA、TrkB、TrkC和p75NTR）結(jié)合，被信號內(nèi)體包裹后經(jīng)逆向軸突運輸?shù)桨w和軸突，促進胞體合成蛋白質(zhì)，調(diào)控神經(jīng)元生長、增殖和存活等。ALS中微管異?？赡芡ㄟ^影響神經(jīng)營養(yǎng)因子的定位及其與受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)下游信號分子如pERK1/2、B-Raf和p-p38的表達，進而引起運動神經(jīng)元變性死亡[55]。

4 結(jié)論和展望

微管是重要的細胞骨架，參與調(diào)控神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和軸突運輸?shù)冗^程。微管結(jié)構(gòu)和功能的維護需要微管末端蛋白、MAPs、微管剪切蛋白以及翻譯后修飾的tubulin等相互協(xié)調(diào)，可形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。而ALS早期出現(xiàn)微管異?？赡芡ㄟ^神經(jīng)營養(yǎng)因子運輸障礙、自噬障礙、線粒體功能障礙等引起運動神經(jīng)元變性死亡。目前研究發(fā)現(xiàn)微管調(diào)節(jié)藥物對治療ALS有潛在作用，這為ALS臨床治療提供新思路和參考，有待深入研究開發(fā)。