殷庭萱，李藝然，劉志伊，徐 巖，賈文寧，劉金輝

(南昌大學(xué)a.瑪麗女王學(xué)院2017級； b.醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南昌 330006)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)是常見的呼吸道病原體，廣泛地存在于口腔或鼻咽部，約有5%～10%的健康成人和20%～40%的健康兒童攜帶此菌[1]。在人體中，S.pneumoniae感染所致疾病的種類與嚴(yán)重程度與其定植能力和侵襲部位有關(guān)，S.pneumoniae可以導(dǎo)致鼻竇炎、中耳炎和侵襲性肺炎。在特定的病理情況下，細(xì)菌可以侵入血液導(dǎo)致菌血癥，并最終穿透血腦屏障導(dǎo)致侵襲性腦膜炎。大多數(shù)感染和死亡病例見于機(jī)體免疫力較低的65歲以上老年人和5歲以下兒童[2]。采用S.pneumoniae感染動物模型進(jìn)行的研究結(jié)果表明，其毒力因子神經(jīng)氨酸酶A(neuraminidase A,NanA)參與S.pneumoniae的侵襲與擴(kuò)散，在S.pneumoniae所致的多種侵襲性疾病中起重要作用[3]。本文對NanA在感染中的毒力機(jī)制進(jìn)行簡要綜述。

1 肺炎鏈球菌毒力因子簡介

S.pneumoniae感染與多種毒力因子的表達(dá)有關(guān)，包括莢膜多糖、菌毛、S.pneumoniae溶素蛋白及多種蛋白酶類等分子。莢膜多糖不僅是細(xì)菌產(chǎn)生毒力的必需條件，幫助其抵抗宿主吞噬細(xì)胞的吞噬作用，有利于細(xì)菌在宿主體內(nèi)大量繁殖，還具有抗原性，是S.pneumoniae分型的重要依據(jù)[4]。菌毛是S.pneumoniae胞外菌體結(jié)構(gòu)之一，幫助細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞等各種固體物質(zhì)的表面，提高細(xì)菌侵襲能力并參與生物膜形成。溶血素(pneumolysin,Ply)是細(xì)菌胞內(nèi)蛋白，經(jīng)自溶酶作用釋放后可以通過形成跨膜孔溶解真核細(xì)胞，并激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，刺激炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，與S.pneumoniae感染導(dǎo)致的高死亡率及急性致死性肺炎和心肌損傷密切相關(guān)[5]。此外，S.pneumoniae表面蛋白(pneumococcal surface protein A,PspA)、S.pneumoniae表面黏附素A(pneumococcal surface adhensin A,PsaA)等表面蛋白也都被證實(shí)在S.pneumoniae致病過程中發(fā)揮重要作用。S.pneumoniae產(chǎn)生多種糖水解酶，通過對宿主細(xì)胞膜糖復(fù)合物的脫糖基化來促進(jìn)細(xì)菌的黏附和定植，降解產(chǎn)物糖基還可作為細(xì)菌繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)。在這些糖水解酶中，神經(jīng)氨酸酶致病性最強(qiáng)，具有降解唾液酸的酶活性，可以分解宿主細(xì)胞表面或體液中的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復(fù)合物末端的唾液酸殘基。

2 神經(jīng)氨酸酶分子結(jié)構(gòu)特征

神經(jīng)氨酸酶是S.pneumoniae表達(dá)的一種重要毒力因子，參與該菌致病過程。S.pneumoniae的基因組可編碼3種同源神經(jīng)氨酸酶：NanA、NanB和NanC，三者在臨床分離株的基因頻率分別是100%、97%和36%～51%[6]，蛋白分子量依次為114、77、82 kD[2]。三者之中NanA活性最強(qiáng)，活性中心保守性最高，且在所有S.pneumoniae感染的臨床分離株中廣泛表達(dá)，說明S.pneumoniae的感染與NanA的毒力機(jī)制密切相關(guān)。NanA的編碼基因長約3108 bp，其蛋白產(chǎn)物約含1035 aa，可分為N端信號肽(aa1-120)、N端凝集素域(aa121-305)、催化域(aa326-437、aa532-822)、C端膜結(jié)合域(aa823-1035)等多個結(jié)構(gòu)域[7]。各個結(jié)構(gòu)域的功能不同，凝集素域又稱為碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate-binding module,CBM40)，可特異性識別聚糖末端唾液酸(sialic acids)，并引導(dǎo)NanA酶活性關(guān)鍵基團(tuán)催化域與之結(jié)合。這一區(qū)域已被證實(shí)在細(xì)菌對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)的黏附和侵襲方面起重要作用，因此其可能是誘發(fā)細(xì)菌性腦膜炎的關(guān)鍵因子[8]。

NanA蛋白催化域呈現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶家族經(jīng)典的六葉β螺旋槳樣折疊結(jié)構(gòu)，活性中心含有對底物唾液酸進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的氨基酸殘基，并包含一段功能未知的插入域(insertion domain)。C端膜結(jié)合域包含一段LPETG基序(motif)，其在S.pneumoniae轉(zhuǎn)肽酶A(sortase A,SrtA)作用下將NanA錨定在細(xì)胞壁表面，而NanB和NanC因缺失該序列而直接分泌到胞外，進(jìn)入機(jī)體組織液[9]。

在NanB和NanC蛋白結(jié)構(gòu)中，凝集素域和催化域在多種域間相互作用下形成堅(jiān)硬球狀體直接相連，而在NanA中2個結(jié)構(gòu)域彼此分離，由一段長度為16 aa的靈活連接體隔開，因而具有良好的柔韌性[10]。NanA具有廣泛的底物作用范圍，可大量識別、分解α-2,3鍵連接的唾液酸、α-2,6鍵連接的唾液酸和α-2,8鍵連接的唾液酸等3種底物，而NanB和NanC主要分解α-2,3鍵連接的唾液酸[2]。此外，生物信息學(xué)分析顯示NanA蛋白表面以負(fù)性電荷為主，活性中心則以正性電荷為主，這種特殊的電荷分布也能增強(qiáng)其對呼吸道上皮細(xì)胞的黏附和對天然底物唾液酸的特異性結(jié)合能力[11]。

3 NanA致病機(jī)制

3.1 促進(jìn)細(xì)菌黏附與定植

唾液酸也稱乙?；窠?jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)，是一種細(xì)胞保護(hù)因子，廣泛分布于宿主胞膜表面，具有多種重要的細(xì)胞生物學(xué)功能。成功定植于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞是S.pneumoniae的感染過程的第一步，而NanA對唾液酸的切割降解是幫助S.pneumoniae定植的重要分子機(jī)制。因?yàn)樗拗魃掀ぜ?xì)胞表面所含的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖復(fù)合物末端多為唾液酸殘基。尤其是唾液酸化的糖蛋白如黏蛋白(mucins)在呼吸道黏膜表面表達(dá)水平較高，在黏膜表面形成了高粘稠度的粘液屏障。NanA對這些表面分子的唾液酸殘基裂解破壞了它們所形成的粘液分子屏障，使細(xì)菌得以定植上皮細(xì)胞，進(jìn)而繁殖擴(kuò)散到更深層的組織部位[12]。

S.pneumoniae對真核細(xì)胞的黏附過程分為兩步，首先與宿主細(xì)胞表面糖復(fù)合物進(jìn)行較松散的相互作用，后與細(xì)菌侵襲相關(guān)的宿主受體進(jìn)行更緊密、特異性更高的結(jié)合。NanA在第一步發(fā)揮作用：當(dāng)細(xì)菌跨過粘液素屏障接觸到上皮細(xì)胞后，NanA裂解宿主細(xì)胞表面寡糖，暴露出下方的隱性受體，增強(qiáng)細(xì)菌對組織的黏附。NanA缺失的S.pneumoniae變異株在體外與在南美栗鼠氣管組織結(jié)合的能力較野生型下降，在體內(nèi)經(jīng)鼻感染后誘發(fā)下呼吸道感染的能力也減弱[13]。

感染組織后，S.pneumoniae需要通過糖類發(fā)酵代謝產(chǎn)生的能量來維持活性。盡管呼吸道表面的游離糖濃度有限，S.pneumoniae可以利用包括神經(jīng)氨酸酶在內(nèi)的一系列糖苷酶對宿主糖基化分子的水解作用來滿足其營養(yǎng)需求。其中，裂解并移除末端唾液酸是細(xì)菌對宿主糖復(fù)合物進(jìn)行連續(xù)降解的第一步也是必要的一步，因此神經(jīng)氨酸酶被認(rèn)為是S.pneumoniae最關(guān)鍵的糖水解酶[14]。此外，經(jīng)酶作用釋放的游離唾液酸在體內(nèi)外均可作為擴(kuò)散信號，促進(jìn)S.pneumoniae在體內(nèi)轉(zhuǎn)移、繁殖，并可以誘導(dǎo)細(xì)菌經(jīng)鼻嗅球侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)非血源性腦膜炎[15]。

3.2 促進(jìn)生物膜形成

生物膜是一種包裹在細(xì)胞外基質(zhì)中的細(xì)菌的表面附著群落，形成生物膜是S.pneumoniae在上皮組織定植與生存的重要過程之一，在鼻竇炎患者的鼻中隔活檢標(biāo)本上、實(shí)驗(yàn)感染小鼠的鼻中隔上皮以及體外培養(yǎng)的呼吸上皮細(xì)胞上，都能夠檢測到S.pneumoniae生物膜的存在[16]。當(dāng)S.pneumoniae在生物膜環(huán)境中生長時，NanA表達(dá)水平上調(diào)提示其在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用[17]，其作用主要是促進(jìn)細(xì)菌微菌落的形成，及以微菌落為基本單位形成成熟的生物膜。而NanA缺失的S.pneumoniae菌株形成生物膜能力顯著下降[18]。PARKER等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)通過與底物競爭拮抗NanA活性，最終導(dǎo)致S.pneumoniae生物膜形成量顯著下降。這些研究表明NanA在S.pneumoniae生物膜的形成過程起重要作用。

NanA促進(jìn)S.pneumoniae生物膜形成的機(jī)制是復(fù)雜的，目前認(rèn)為其作用可能與酶活性有關(guān)，一方面通過降解宿主細(xì)胞表面糖基復(fù)合物，使游離唾液酸大量釋放促進(jìn)生物膜形成[20]，另一方面通過暴露下層半乳糖殘基調(diào)節(jié)S.pneumoniae對碳源的攝取和利用促進(jìn)生物膜形成[18]。WREN等[21]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)NanA在生物膜形成過程中也發(fā)揮著與酶活性無關(guān)的獨(dú)特作用。生物膜給予細(xì)菌群體共享有利遺傳信息的機(jī)會，使之對抗菌肽具有更高的抵抗力，使得S.pneumoniae從最初的無癥狀定植逐步演化為具有誘發(fā)侵襲性疾病的潛能。

3.3 在S.pneumoniae侵襲性感染中的作用

NanA參與S.pneumoniae所致的死亡率普遍較高的侵襲性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)發(fā)生與進(jìn)展過程，如敗血癥、腦膜炎和非典型溶血性尿毒綜合征(pneumococcal hemolytic uremic syndrome,pHUS)。S.pneumoniae通過多種途徑進(jìn)入血流，包括淋巴管途徑、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞損傷途徑以及內(nèi)皮細(xì)胞的直接侵襲途徑。進(jìn)入血液后，NanA通過對人體血清成分的脫糖基化來干擾補(bǔ)體因子C3在細(xì)菌表面的沉積[2]，減少中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用，有利于細(xì)菌逃避機(jī)體免疫防御而在血液中繁殖擴(kuò)散。另一方面，NanA從細(xì)胞膜復(fù)合糖結(jié)構(gòu)中去除唾液酸將減少補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子H與自身細(xì)胞表面的結(jié)合[22]。H因子作為補(bǔ)體激活途徑之替代途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑制補(bǔ)體反應(yīng)激活因子C3b在生物表面的沉積，保護(hù)自身細(xì)胞不受攻膜復(fù)合體(membrane attack complex,MAC)的破壞。因此，當(dāng)H因子與紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及血小板上唾液酸的相互作用減少時，缺乏調(diào)節(jié)的補(bǔ)體系統(tǒng)被激活可能導(dǎo)致全血溶血和血小板聚集，造成嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。此外，NanA對某些關(guān)鍵免疫因子的脫糖基化作用將削弱其在免疫反應(yīng)抵御病原體侵襲中的調(diào)控能力，有利于S.pneumoniae在體內(nèi)生存繁殖。

血源細(xì)菌沿血管進(jìn)入腦部，附著并穿透以單層hBMECs為主的血腦屏障，是腦膜炎發(fā)生機(jī)制中的首要過程。NanA缺失型S.pneumoniae對hBMECs的黏附、侵襲的能力較野生型下降約90%[23]，表明NanA在引發(fā)腦膜炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用，細(xì)菌穿透血腦屏障后對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害則與其它毒力因子協(xié)同完成。在內(nèi)皮細(xì)胞上，NanA裂解末端唾液酸，修飾宿主細(xì)胞表面糖復(fù)合物以暴露親和力更高的受體，促進(jìn)細(xì)菌粘附并穿透內(nèi)皮細(xì)胞。此外，NanA蛋白N端凝集素結(jié)構(gòu)域能夠充分活化內(nèi)皮細(xì)胞，激活趨化因子[如interleukin 8(IL-8)]和中性粒細(xì)胞募集，在促進(jìn)S.pneumoniae對hBMECs的侵襲以及誘發(fā)急性腦膜炎的過程中發(fā)揮重要且特異的作用[24]。

3.4 在與流感病毒協(xié)同感染中的作用

流感爆發(fā)或流行期間，肺炎發(fā)病率與死亡率過高被認(rèn)為與S.pneumoniae和流感病毒之間的致死性協(xié)同感染有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)S.pneumoniae的NanA蛋白可以促進(jìn)流感病毒從宿主細(xì)胞表面釋放，并在呼吸道組織快速擴(kuò)散[25]。NanA促流感病毒擴(kuò)散作用呈濃度依賴性：一定濃度下，可以增強(qiáng)流感病毒的復(fù)制能力；大量存在時，病毒的擴(kuò)散能力和產(chǎn)量反而下降[26]。過量NanA可能通過裂解宿主細(xì)胞表面乳糖分子末端唾液酸(SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal)，清除病毒受體，干擾病毒對宿主的黏附[27]。

同時表達(dá)Nan和S.pneumoniae的NanA是流感病毒和S.pneumoniae2種病原體達(dá)到完全協(xié)同所必需的。共感染的流感病毒促進(jìn)S.pneumoniae在鼻腔定植并加重疾病進(jìn)展這一作用已被證實(shí)。為研究S.pneumoniae的NanA在共感染中的致病作用，WREN等[21]采用小鼠模型進(jìn)行研究，鼻腔定植力與感染力均出現(xiàn)嚴(yán)重受損的S.pneumoniae的NanA缺失突變株在與表達(dá)神經(jīng)氨酸酶的甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)共感染時，S.pneumoniae突變株的定植力與致病力均得以提升，但仍達(dá)不到野生S pneumonia的致病水平[21]，即流感病毒的神經(jīng)氨酸酶不能完全彌補(bǔ)S.pneumoniae缺失的NanA的致病作用，說明2種神經(jīng)氨酸酶分子的致病機(jī)制存在某些未知的差異，它們在2種病原共感染過程中起協(xié)同作用，從而加重S.pneumoniae疾病進(jìn)展。

4 靶向NanA的藥物與疫苗的研制

S.pneumoniae作為引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最主要的病原體，相關(guān)藥物與疫苗的開發(fā)一直是研制重點(diǎn)。隨著抗生素耐藥與人口老齡化的加劇，S.pneumoniae對一些抗生素表現(xiàn)多重耐藥，包括青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類及頭孢菌素類，且耐藥率逐年上升[27]。有效的S.pneumoniae疫苗很大程度上緩解了耐藥危機(jī)，現(xiàn)行使用的疫苗以莢膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine,PPV)(PPV23)和蛋白質(zhì)-莢膜多價結(jié)合疫苗(protein-capsule multivalent conjugate vaccine，PVC)(PCV7、PCV10、PCV13)為主。多價結(jié)合疫苗將莢膜和蛋白載體相結(jié)合，激發(fā)T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫原性和持久的免疫保護(hù)，顯著降低兒童(尤其2歲以下)S.pneumoniae肺炎發(fā)病率[28]。但由于細(xì)菌持續(xù)變異和選擇作用，其型別限制和莢膜血清轉(zhuǎn)換等缺點(diǎn)逐漸展現(xiàn)，“第三代疫苗”重組蛋白疫苗因其保守性好、免疫原性強(qiáng)、價格相對低廉等優(yōu)勢得到廣泛關(guān)注[29]。

相比于傳統(tǒng)的血清接種，黏膜免疫是一種很有潛力的新型接種方式，可同時誘導(dǎo)黏膜和全身免疫反應(yīng)，對主要定植于人類呼吸道黏膜表面的S.pneumoniae引發(fā)的肺部疾病提供更特異的保護(hù)[30]。有實(shí)驗(yàn)[31]證實(shí)，用NanA蛋白黏膜免疫小鼠后可誘導(dǎo)高滴度抗體的產(chǎn)生，能有效抵抗致病性S.pneumoniae的感染，抑制其在宿主鼻咽部和肺部的定植，提示NanA或可作為新型疫苗的載體或融合蛋白，具有疫苗研發(fā)價值。

以S.pneumoniae的NanA蛋白毒力因子為靶點(diǎn)的新型藥物也在不斷研制中。從植物中提取的小分子藥物β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(β-Sitosterol-3-O-glucopyranoside，SOG)可以通過抑制SrtA酶活性阻止NanA在細(xì)胞壁上錨定[9]，進(jìn)而影響NanA在促進(jìn)細(xì)菌于呼吸道上皮黏附和定植中的作用，緩解肺組織病理變化。由于流感病毒神經(jīng)氨酸酶和NanA結(jié)構(gòu)存在一定的相似性，多種雙靶向該相似結(jié)構(gòu)的神經(jīng)氨酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitors,NAIs)也在研究與評估之中，這些藥物分子通過靶向抑制2種病原體之間的神經(jīng)氨酸酶的協(xié)同作用，降低流感流行期間死亡率和S.pneumoniae二次感染發(fā)生率，目前研究發(fā)現(xiàn)桂木黃酮(Artocarpin)效果最優(yōu)，是目前唯一對S.pneumoniae生長和生物膜形成都有抑制作用的NAI[25]。

5 結(jié)語

NanA作為S.pneumoniae的一種重要毒力因子，在S.pneumoniae的毒力及疫苗研發(fā)方面都起著重要作用。一方面，該蛋白主要在細(xì)菌致病的起始階段發(fā)揮作用，以多樣化的作用機(jī)制參與S.pneumoniae在人體不同部位的感染。另一方面，以NanA為靶點(diǎn)的抗S.pneumoniae藥物和新型疫苗的研制為減輕S.pneumoniae感染帶來的公共衛(wèi)生壓力提供了新的途徑。雖然NanA毒力性質(zhì)的認(rèn)識已取得了一定的研究成果，但某些作用機(jī)制的結(jié)論處于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣游镫A段，并且模型動物與人體在組織結(jié)構(gòu)功能上存在較大差異，加之NanA的氨基酸序列和抗原性在不同型別的S.pneumoniae中存在一定變異，因此研究成果最終轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步仔細(xì)驗(yàn)證。