蕭文澤，張佳敏

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是一種廣泛分布于植物、單細(xì)胞生物、藻類、細(xì)菌、無脊椎動(dòng)物[1]和脊椎動(dòng)物中的內(nèi)源性吲哚胺。在脊椎動(dòng)物中，循環(huán)中的褪黑素主要來源于松果體，此外還有其他器官，如胃腸道、上皮毛囊、皮膚、視網(wǎng)膜、唾液腺、血小板和產(chǎn)生褪黑素的淋巴細(xì)胞[2]。視網(wǎng)膜中專門的感光細(xì)胞檢測到可見光，將信息直接投射到負(fù)責(zé)晝夜節(jié)律起搏器的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），觸發(fā)松果體在黑暗中生成褪黑素。褪黑素的最大血漿濃度通常在黑暗發(fā)生后3～5 h發(fā)生，在日常光照期間其濃度很低或甚至檢測不到[3]。

內(nèi)源性褪黑素的合成是一個(gè)多步驟的過程，血液中色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶羥化生成5-羥胺（5-hydroxytryptophan，5-HTP）。通過芳族氨基酸脫羧酶將5-HTP轉(zhuǎn)化為5-羥色胺（serotonin，5-HT），然后通過芳基烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶將5-HT轉(zhuǎn)化為N-乙?；z氨酸（N-acetylserine，NAS）。褪黑素合成的最后一步是通過羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶將NAS轉(zhuǎn)化為褪黑素[3]。松果體褪黑素以晝夜節(jié)律的形式立即釋放到血流中，以響應(yīng)上述通過視網(wǎng)膜通路收到的光周期信息。有趣的是，正常生理情況下除了松果體，大多數(shù)的松果體外細(xì)胞不能以晝夜節(jié)律的方式產(chǎn)生褪黑素，并且通常不以任何顯著的量釋放到血流中[4]。

已知有三種主要的褪黑素降解途徑：經(jīng)典的經(jīng)肝分解代謝途徑，產(chǎn)生6-羥基褪黑素，然后作為硫酸鹽結(jié)合物經(jīng)腎排出[3,5]；產(chǎn)生5-甲氧基吲哚乙酸或5-甲氧基色氨醇的替代吲哚途徑；產(chǎn)生N(1)-乙?；?N(2)-甲酰基-5-甲氧基尿嘧啶[N(1)-acetyl-N(2)-formyl-5-methoxykynuramine，AFMK]的犬尿氨酸路徑。除了褪黑素具有抗氧化特性，褪黑素的兩種重要代謝物AFMK 和N1-乙酰基-5-甲氧基犬尿嘧啶（N1-acetyl-5-methoxykynuramine，AMK）也具有強(qiáng)大的自由基清除活性。

褪黑素是具有許多功能的多任務(wù)分子，包括參與睡眠開始、情緒調(diào)節(jié)、性行為、血管舒縮控制和免疫調(diào)節(jié)。此外，褪黑素具有抗炎和抗氧化作用，影響能量代謝[5]。褪黑素的作用可能是通過與特定的膜結(jié)合受體相互作用介導(dǎo)的，或者它們可能與受體無關(guān)；也可能通過其直接的自由基清除功能。褪黑素受體包括膜和核結(jié)合位點(diǎn)。兩種膜結(jié)合的褪黑素受體是G 蛋白偶聯(lián)的七種跨膜受體。MT1 受體在視網(wǎng)膜、卵巢、睪丸、乳腺、膽囊、肝臟、腎臟、免疫細(xì)胞、外分泌胰腺和心血管系統(tǒng)中表達(dá)，而MT2 受體在十二指腸腸上皮細(xì)胞、免疫系統(tǒng)、下丘腦、SCN、視網(wǎng)膜、垂體、血管、睪丸、腎、胃腸道、乳腺、脂肪組織和皮膚中表達(dá)[5]。此外，MT1 褪黑素受體主要與生殖、代謝和血管收縮功能有關(guān)，而MT2 受體參與控制晝夜節(jié)律、視網(wǎng)膜多巴胺釋放和血管舒張。此外，褪黑素還可與MT3受體（醌還原酶Ⅱ）結(jié)合，然而其不符合傳統(tǒng)的褪黑素受體的標(biāo)準(zhǔn)；它被認(rèn)為是抗瘧藥物的分子靶點(diǎn)，似乎參與調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓。盡管MT3受體尚未在人體中發(fā)現(xiàn)，但其在倉鼠的心臟、脂肪組織和腦中表達(dá)。

褪黑素的核結(jié)合位點(diǎn)也被確定，褪黑素也可能通過類視黃醇孤兒受體α（the retinoid-related orphan nuclear receptor-α，RORα）和類視黃醇Z受體家族的孤兒受體起作用。RORα受體在所有哺乳動(dòng)物組織中普遍表達(dá)，并且在淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中檢測到高水平，而RORβ亞型在腦、松果體、視網(wǎng)膜和脾中表達(dá)。褪黑素也可能與細(xì)胞質(zhì)蛋白相互作用，包括鈣調(diào)蛋白和鈣網(wǎng)蛋白，它們分別參與細(xì)胞骨架調(diào)控和核受體調(diào)控。

褪黑素晝夜變化失調(diào)與多種病理過程有關(guān)。在乳腺癌、肺癌和前列腺癌患者中觀察到的內(nèi)源性褪黑素顯著降低，其夜間褪黑素水平低于健康人[6]；在患有代謝綜合征、糖尿病或睡眠障礙的患者中，褪黑素的晝夜節(jié)律也存在失調(diào)[6]。此外，近幾十年來，由于夜間光線增加，人們將大部分時(shí)間花在室內(nèi)，改變了自然的明暗周期；這些生活方式因素誘導(dǎo)晝夜節(jié)律系統(tǒng)紊亂，引起褪黑素節(jié)律的紊亂。流行病學(xué)研究表明，晝夜節(jié)律喪失與心血管疾病、糖尿病、肥胖、認(rèn)知和情感障礙、早衰和某些類型的癌癥的發(fā)病率增加有關(guān)[7]。在整個(gè)生命中，褪黑素水平也逐漸降低，幼兒的夜間褪黑素水平最高。在老化過程中，盡管存在很大的個(gè)體差異，褪黑素峰值和總褪黑素產(chǎn)量的幅度顯著降低。同時(shí)，褪黑素也是一種非常安全的分子，通過任何途徑給藥時(shí)，它很容易被吸收，容易穿過胎盤或血腦屏障。

1 褪黑素和炎癥

實(shí)驗(yàn)表明，褪黑素通過在不同病理生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞以及生成抗炎細(xì)胞因子來發(fā)揮其抗炎作用[8]。Carrillo等[8,9]研究表明，肥大細(xì)胞系中褪黑素通過作用于褪黑素受體抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放來抗炎。褪黑素及其代謝物AFMK和AMK的抗炎作用是抑制前列腺素合成，粘附分子的產(chǎn)生及下調(diào)巨噬細(xì)胞中環(huán)氧合酶2 的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮粘附，以及白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移，同時(shí)減少多形核細(xì)胞募集到炎癥部位[10]。此外，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生對炎癥有顯著的促進(jìn)作用，褪黑素還通過清除自由基和激活內(nèi)源性抗氧化劑防御反應(yīng)炎癥過程，這是由于其重要且眾所周知的抗氧化性質(zhì)[11]。

NF-κB是一種普遍存在的氧化應(yīng)激敏感性轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)（包括炎癥、先天免疫、細(xì)胞生長和死亡）等多種重要基因中發(fā)揮重要作用。NF-κB主要位于細(xì)胞漿，活化后，易位至細(xì)胞核并與調(diào)節(jié)促炎基因轉(zhuǎn)錄的特定元件結(jié)合。抑制NF-κB活性的手段主要有以下幾方面：①抗氧化劑；②抑制蛋白酶小體的活性：蛋白酶小體是一種具有多種催化功能的蛋白酶復(fù)合物，已磷酸化并泛素化的IκB 可以被蛋白酶小體降解；③抑制IκB激酶（the inhibitor of NF-κB alpha kinase，IκK）活性；④調(diào)節(jié)IκB的含量；⑤抑制p65的生成：用生物技術(shù)設(shè)計(jì)長度為21nt的反義寡核苷酸抑制NF-κB中p65亞基的生成；⑥抑制NF-κB與DNA結(jié)合（封閉NF-κB的DNA結(jié)合域；封閉順式元件上的κB位點(diǎn)）；⑦抑制p65 的轉(zhuǎn)錄活化域[12]。研究表明，褪黑素在炎癥過程中的抗炎作用主要是通過抑制NF-κB 信號通路活化[13]，其具體作用機(jī)制與RORα核受體的基因組效應(yīng)有關(guān)[14]。利用RORα核受體的基因缺陷小鼠，建立膿毒癥模型，并加用褪黑素干預(yù)，結(jié)果表明褪黑素給藥在膿毒癥小鼠中通過SIRT1脫乙酰化使NF-κB活化減弱。褪黑素也抵消了NF-κB相關(guān)基因表達(dá)，將誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和炎性細(xì)胞因子（包括TNFα和IL-1β）的水平降至正常值。褪黑素還恢復(fù)膿毒癥小鼠的氧化還原平衡。因?yàn)镹F-κB 也能誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，所以褪黑素對NF-κB的作用可通過與RORα的結(jié)合來介導(dǎo)。

2 褪黑素與NLRP3炎癥小體

存在于多種細(xì)胞中的炎癥小體是介導(dǎo)炎性半胱天冬酶活化的細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，并且繼而誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18 的分泌。迄今為止，已經(jīng)清楚鑒定五種不同的炎癥小體，包含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體芘結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain, leucine rich repeat and pyrin domain containing，NLRP）1-3、NLRP1、NLRP2、NLRP3、AIM2 和IPAF/NLRC4。其中，NLRP3 是最經(jīng)典的也是研究最多的炎癥小體[15]。

NLRP3 炎癥小體對多種信號有反應(yīng)，包括環(huán)境刺激物、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號、病原體、線粒體衍生的ROS 和受損線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的DNA。NLRP3炎癥小體的激活需要兩個(gè)信號：微生物分子或內(nèi)源性細(xì)胞因子，其通過NF-κB 途徑的活化上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)。因此，NLRP3炎癥小體相關(guān)免疫通路的激活放大了NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[15]。第二個(gè)信號由各種損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）誘導(dǎo)，導(dǎo)致炎性多蛋白復(fù)合物的組裝。一旦炎癥小體被激活，Caspase-1 將pro-IL-1β和pro-IL-18 進(jìn)入其成熟的活性過程并誘導(dǎo)其隨后的分泌。NLRP3 炎癥小體的激活可以幫助宿主防御侵入的細(xì)菌和病原體。然而，炎癥小體的過度激活會(huì)導(dǎo)致炎癥相關(guān)的組織損傷。近2 年研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在多個(gè)炎癥模型中起到抑制NLRP3小體的作用。

細(xì)胞外組蛋白在急性肺損傷過程中產(chǎn)生，激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的募集，是急性肺損傷惡化的主要原因。最近研究表明氣管內(nèi)給予褪黑素通過抑制NLRP3 炎癥小體的組裝來減少急性肺損傷中的肺部炎癥。這種抑制作用不僅通過減少肺中細(xì)胞外組蛋白的釋放來介導(dǎo)，而且通過直接阻斷細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活來介導(dǎo)。然而，作者報(bào)道，TNF-α表達(dá)水平?jīng)]有改變，表明褪黑素僅選擇性影響地NLRP3炎癥小體的活化，可能未涉及NF-κB通路[16]。

此外，最近報(bào)道褪黑素對NLRP3 復(fù)合物相關(guān)的粘膜炎、膿毒癥和衰老等疾病中的治療作用。Ortiz等[17]報(bào)道，在舌頭放射照射后的粘膜炎發(fā)展過程中，線粒體氧化應(yīng)激和生物能障礙通過組裝NLRP3 炎癥小體來促進(jìn)炎癥，從而導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶-1活化并切割成成熟形式的促炎細(xì)胞因子IL-1β，有趣的是，應(yīng)用褪黑素凝膠防止粘膜破裂和潰瘍形成，保護(hù)線粒體免受輻射損傷，并且抑制舌粘膜細(xì)胞中的NF-κB/NLRP3炎癥小體信號傳導(dǎo)激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)褪黑素凝膠對口腔粘膜炎的治療益處與其對NF-κB/NLRP3 信號傳導(dǎo)的抑制作用有關(guān)；此外，也可能是由于褪黑素能保護(hù)上皮細(xì)胞中的線粒體及干細(xì)胞免受輻射。Ortiz 及其同事也首次表明，褪黑素是在大鼠舌頭中合成的，它通過與MT1、MT2 和RORγ受體結(jié)合而以自分泌/旁分泌信號作用于舌粘膜上皮細(xì)胞[17]。

除粘膜表面的上皮細(xì)胞中的NLRP3功能外，炎癥小體還與促成肥胖相關(guān)的慢性炎癥狀態(tài)的促炎性細(xì)胞因子有關(guān)。肥胖可誘導(dǎo)NLRP3 依賴性Caspase-1 激活，從而誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子和促炎反應(yīng)。最近，一項(xiàng)關(guān)于脂肪炎癥的研究證明：外源性褪黑素通過抑制包括NLRP3 在內(nèi)的炎癥小體基因的表達(dá)來抑制脂肪組織的炎癥，所述炎性基因包括含有半胱天冬酶募集域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、半胱天冬酶-1和IL-1β。此外，脂肪組織中的褪黑素降低NF-κB 的磷酸化并抑制下游的NLRP3途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明褪黑素是一種潛在的抗肥胖劑，也可能逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)的全身性炎癥反應(yīng)[14]。

為了闡明褪黑素在調(diào)控NLRP3炎癥小體中的作用機(jī)制，有實(shí)驗(yàn)組利用膿毒癥小鼠模型，證實(shí)褪黑素在膿毒癥中抑制NLRP3 炎性體激活獨(dú)立于其抑制NF-κB 的機(jī)制。Rahim 及其同事發(fā)現(xiàn)膿毒癥誘導(dǎo)的NF-κB活化依賴于RORα表達(dá)的下調(diào)和REV-ERBα的表達(dá)上調(diào)，從而削弱SIRT1的抗炎作用，即不能使p65 脫乙?；?，導(dǎo)致其與細(xì)胞核DNA 的結(jié)合和隨后的基因轉(zhuǎn)錄。這些實(shí)驗(yàn)也解釋褪黑素在RORα+/+小鼠中能阻斷NF-κB活化，但對RORα基因缺失小鼠沒有效果。然而，褪黑素均可使RORα+/+和RORα基因缺失小鼠中NLRP3 炎性體的激活受到抑制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，褪黑素抵抗膿毒癥小鼠線粒體的氧化損傷，降低ROS 的細(xì)胞質(zhì)水平和阻止線粒體釋放mtDNA 的作用是降低NLRP3 炎性體活性的機(jī)制[14]，因?yàn)镽OS 和mtDNA 通常是激活NLRP3炎癥小體的第2信號。

此外為進(jìn)一步評估褪黑素-NLRP3炎性體相互作用，有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因缺乏的小鼠比野生型具有更低的敗血癥炎癥反應(yīng)。比較這些小鼠的敗血癥反應(yīng)，結(jié)果顯示NLRP3基因敲除小鼠經(jīng)褪黑素處理后，發(fā)生的膿毒癥反應(yīng)明顯好轉(zhuǎn)。然而，NLRP3基因敲除的小鼠的時(shí)間節(jié)律相關(guān)基因如CLOCK、BMAL1的表達(dá)被破壞，當(dāng)用褪黑素處理時(shí)，這些基因被恢復(fù)[18]。

為了測試褪黑素的抗炎有益作用，Rahim 及其同事在膿毒癥患者（Eudract 編號2008-006782-83）中進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，這些患者接受新專利的褪黑素注射劑（PCT/ES2015070236）的治療。與該臨床試驗(yàn)有關(guān)的初步數(shù)據(jù)表明褪黑素在人體中具有與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中觀察到的相同的抗炎效果，且無明顯毒副作用[19]。

由于抑制NLRP3炎癥小體，褪黑素的有益作用受到越來越多的關(guān)注，因?yàn)樗c許多炎癥性疾病的改善有關(guān)。Cao 等[20]研究顯示鎘暴露顯著增加肝臟中NLRP3 和活性半胱氨酸蛋白酶-1（p20）的表達(dá)，表明NLRP3參與鎘誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，并且這種類型的肝細(xì)胞死亡是半胱天冬酶-1依賴性。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)，褪黑素治療通過降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平，抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1β、INF-α和IL-6 的產(chǎn)生及NLRP3 的誘導(dǎo)而顯著減輕鎘誘導(dǎo)的肝損傷mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)。褪黑素的保護(hù)作用由硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）-NLRP3 炎癥小體通路介導(dǎo)[19,20]。因此，TXNIP 是細(xì)胞氧化還原平衡的重要內(nèi)源調(diào)節(jié)因子，在急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并在氧化應(yīng)激條件下直接激活NLRP3炎癥小體[21]。靶向TXNIP-NLRP3途徑可代表治療肝病的治療方法[22]。

NLRP3 炎癥小體還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，包括腦出血[23]、缺血性卒中[24]、腦膜炎[25]、帕金森病、谷氨酸相關(guān)腦損傷[26]和蛛網(wǎng)膜下腔出血[27]。最近Dong 等[28,29]證明，褪黑素通過其抗凋亡作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這與NLRP3炎癥小體相關(guān)。總之，觀察到褪黑素具有抗蛛網(wǎng)膜下出血的神經(jīng)保護(hù)特性，誘導(dǎo)存活率增加，以及神經(jīng)學(xué)評分和腦抗氧化劑含量升高，腦水腫、凋亡比率和血腦屏障破壞減少。這些作用涉及抑制NLRP3炎癥小體激活及隨后的IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[30]。

最近從脫乙酰褪黑素合成一種新的褪黑素衍生物5-羥基-2'-異丁基-鏈霉素（5-hydroxy-2'-isobutyl-streptomycin，HIS）。Shim等[31]指出，低濃度的HIS通過干擾NLRP3炎性小體形成復(fù)合體而不伴有對線粒體ROS的抑制，因此不會(huì)降低機(jī)體免疫力同時(shí)避免過度炎癥損傷。

3 結(jié)論

越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究展現(xiàn)出褪黑素在急性炎癥和慢性炎癥治療中的巨大潛力，褪黑素的抗炎作用與調(diào)節(jié)NF-κB信號通路及抑制NLRP3炎癥小體活化有關(guān)，其抗炎的具體機(jī)制涉及與核受體RORα的結(jié)合；對時(shí)間節(jié)律基因CLOCK、BMAL1等的調(diào)節(jié)；以及對線粒體的抗氧化保護(hù)作用等。但目前仍存在不少問題：如褪黑素的最佳應(yīng)用時(shí)間和服用途徑需進(jìn)一步研究；褪黑素在急性炎癥慢性化的過程中起何種作用尚不清楚，未來的研究將進(jìn)一步闡明這些機(jī)制。