馬 璐 楊 馳 肖冬來 應(yīng)正河 江曉凌 劉曉瑜 林衍銓

廣葉繡球菌液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化

馬 璐 楊 馳 肖冬來 應(yīng)正河 江曉凌 劉曉瑜 林衍銓*

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350014）

為獲得菌球密度高、直徑小和活力強(qiáng)的廣葉繡球菌液體菌種，經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)，得到適宜培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH 5.0，裝液量140～170 mL，接種量9%，搖床轉(zhuǎn)速120～150 r/min；并確定液體菌種的適宜培養(yǎng)終點(diǎn)為9～10天，此時(shí)菌球直徑1.07±0.03 mm，菌球密度111±11.53 個(gè)/mL，接種后菌絲生長(zhǎng)速度2.34±0.18 mm/d。

液體培養(yǎng)；培養(yǎng)條件；培養(yǎng)終點(diǎn)；菌絲活力

廣葉繡球菌（）又名繡球菌，是一種“藥食同源”的大型真菌，營(yíng)養(yǎng)豐富且富含活性多糖（β-葡聚糖）[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，繡球菌具有抗腫瘤[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、促進(jìn)傷口愈合[4]及提高造血功能[5]等多種保健功效。

目前，繡球菌工廠化栽培均采用瓶裝木屑菌種，原種培養(yǎng)時(shí)間50～55天。液體菌種菌齡一致、制備周期短，便于機(jī)械化接種，更適合食用菌工廠化生產(chǎn)。目前繡球菌液體培養(yǎng)研究多以提高次生代謝產(chǎn)物[6, 7]或菌絲生物量[8-10]為主，菌絲生物量最大時(shí)的菌球活力情況卻少有關(guān)注。

繡球菌液體培養(yǎng)初期，菌球表面有呈絨毛狀的毛刺，此時(shí)菌絲活力最強(qiáng)，但生物量較?。浑S著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌球表面逐漸光滑，菌絲生物量增大，但菌絲活力下降。因此，菌絲生物量在一定程度上不應(yīng)作為判斷液體菌種優(yōu)劣的首要指標(biāo)。理想的液體菌種應(yīng)在保證一定菌絲生物量前提下，減小菌球直徑、增大菌球密度、提高菌球活力。

前期研究已獲得繡球菌液體培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基配方[11]，但獲得的菌球直徑較大而密度較小。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化液體菌種培養(yǎng)條件，勻漿處理后進(jìn)行擴(kuò)繁，并確定液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)，為繡球菌工廠化栽培中液體菌種制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

廣葉繡球菌（）（閩認(rèn)菌2013005）菌種由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

①母種培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉16 g/L。②PDPK液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L，KH2PO43 g/L。③液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，玉米粉30 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L。④液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，面粉4 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）菌種活化及培養(yǎng)。母種接種于PDA培養(yǎng)皿中24～25 ℃避光倒置培養(yǎng)25天后，從活化菌落邊緣挑取菌塊（=6 mm）接種至PDPK液體培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶，裝液量100 mL），24～25 ℃、150 r/min避光培養(yǎng)10天，得活化菌種。

（2）液體菌種培養(yǎng)采用250 mL三角瓶，裝液量100 mL，對(duì)液體菌種培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，避光培養(yǎng)20天后測(cè)定菌球密度、菌絲體生物量。具體實(shí)驗(yàn)水平如下。

培養(yǎng)基初始pH：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0（滅菌后用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)），接種量8%（/），培養(yǎng)溫度24～25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

接種量（/）：3%、6%、9%、12%、15%，初始pH自然，培養(yǎng)溫度24～25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

培養(yǎng)溫度：22、23、24、25、26 ℃，初始pH自然，接種量8%（/），轉(zhuǎn)速150 r/min。

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速：120、150、180、210 r/min，初始pH自然，接種量8%（/），培養(yǎng)溫度24～25 ℃。

（3）液體菌種制備。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)繡球菌液體菌種進(jìn)行培養(yǎng)（250 mL三角瓶，裝液量100 mL），培養(yǎng)結(jié)束后用勻漿機(jī)打碎（5 000 r/min，10 s），以接種量8%（/）接種至液體菌種培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速180 r/min，24～25 ℃培養(yǎng)。接種4天后，每隔2天測(cè)定培養(yǎng)液pH、菌球直徑、菌球密度、菌球體積、菌絲體生物量、培養(yǎng)液還原糖含量和菌絲生長(zhǎng)速度，分析菌種活力，確定培養(yǎng)終點(diǎn)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

（1）培養(yǎng)液pH。培養(yǎng)結(jié)束后，采用pH計(jì)（奧豪斯，ST3100）測(cè)定培養(yǎng)液pH。

（2）菌球直徑與菌球密度。采用移液槍，隨機(jī)吸取一定體積培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液中菌球排列成直線，測(cè)總長(zhǎng)度，取平均值，得菌球直徑（mm/個(gè)）；對(duì)培養(yǎng)液中的菌球計(jì)數(shù)，得菌球密度（個(gè)/mL）。

（3）菌球體積及菌絲體生物量。用清水充分沖洗經(jīng)紗布過濾的菌球，倒入量筒靜置3 min后，測(cè)定菌球體積，隨后將菌球于50 ℃烘干至恒重，電子天平稱重。

（4）培養(yǎng)液還原糖含量。培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心10 min后，采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定培養(yǎng)液還原糖含量。

（5）菌絲生長(zhǎng)速度與菌落白度。將采用繡球菌工廠化栽培配方[12]的培養(yǎng)料裝入培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿15 g，高壓滅菌，冷卻后備用。從液體菌種內(nèi)

隨機(jī)挑取不同培養(yǎng)時(shí)間的菌球，接種至培養(yǎng)皿中，24～25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）。同時(shí)采用色差儀（Konica Minolta CR410）測(cè)定菌落顏色，以白色色卡（X=84.99，Y=87.00，Z=96.70）為對(duì)照，測(cè)定結(jié)果（ΔE*ab）越小，說明菌落顏色與白色色卡相差越小，菌落越白。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1）初始pH。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基pH降低至3.37～3.88。當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，菌球密度最大，為55.5±5.0個(gè)/mL，但與其他處理無顯著性差異。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5.0時(shí)，菌絲體生物量最大，為8.5±0.78 g/L，差異顯著（圖1）。

圖1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)繡球菌液體培養(yǎng)效果的影響

（2）裝液量。裝液量80 mL時(shí)，菌球密度最大，為91.5±5.0 個(gè)/mL，但此時(shí)的菌絲體生物量最低，僅為6.5±0.4 g/L；繼續(xù)增加裝液量，菌球密度顯著降低，菌絲體生物量與菌球直徑均顯著增大。裝液量為170 mL時(shí)，菌絲體生物量最大，為9.5±0.6 g/L（圖2）。綜合考慮菌球直徑、菌球密度及菌絲體生物量，適宜的裝液量應(yīng)為140～170 mL。

（3）接種量。隨著接種量增大，菌球密度先升高、后降低，差異不顯著。接種量在3%～9%之間，菌絲體生物量顯著提高，9%時(shí)達(dá)最高，為4.2±0.4 g/L；繼續(xù)增大接種量，菌絲體生物量基本維持不變，無顯著性差異（圖3）。

圖2 裝液量對(duì)繡球菌液體培養(yǎng)效果的影響

圖3 接種量對(duì)繡球菌液體培養(yǎng)效果的影響

（4）搖床轉(zhuǎn)速。在搖床轉(zhuǎn)速120～210 r/min范圍內(nèi)，隨轉(zhuǎn)速增大，菌球密度逐漸升高，菌絲體生物量逐漸降低，差異不顯著（圖4）。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)液體培養(yǎng)效果的影響

經(jīng)綜合分析，得出液體菌種適宜培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 5.0，裝液量140～170 mL，接種量9%，轉(zhuǎn)速120～150 r/min。

2.2 液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)的確定

（1）培養(yǎng)基pH及菌球直徑。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基pH呈下降趨勢(shì)。培養(yǎng)前期（0～6天），pH基本保持穩(wěn)定，隨后迅速下降至3.88，此后降幅放緩，說明從第6天開始，菌絲已逐漸適應(yīng)新的培養(yǎng)基，酸性代謝物質(zhì)開始逐漸積累。接種第0～8天，勻漿后的菌絲逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)，個(gè)別生長(zhǎng)較快的菌絲已成小菌球；從第8天至培養(yǎng)結(jié)束，菌球直徑基本維持在1.1 mm左右（圖5）。

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)基pH及菌球直徑

（2）不同培養(yǎng)時(shí)間的菌球密度及菌球體積。菌球密度可在一定程度上反映接種后菌絲萌發(fā)點(diǎn)。從第8天開始，菌球密度逐漸增大，至第16天達(dá)到最大，隨后基本維持穩(wěn)定（圖6）。

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間的菌球密度及體積

菌球體積在培養(yǎng)過程中整體呈下降趨勢(shì)，其中第6～14天下降明顯，之后基本保持穩(wěn)定。培養(yǎng)初期，由于菌球表面蓬松呈絨毛狀，單位時(shí)間內(nèi)沉降速度慢，因此在培養(yǎng)基中所占體積較大，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌球表面絨毛逐漸消失，體積減小。采用體視顯微鏡對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的菌球進(jìn)行觀察，結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖7）。

圖7 液體菌種培養(yǎng)過程中菌球形態(tài)變化

（3）菌絲體生物量及培養(yǎng)基還原糖含量。在繡球菌液體菌種培養(yǎng)過程中，菌絲體生物量呈上升趨勢(shì)（圖8）：第0～8天，變化不明顯；8～16天期間，迅速增加，差異顯著（<0.05）；16天以后，增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩；第20天時(shí)達(dá)到最大（3.9±0.26 g/L）。

繡球菌液體菌種培養(yǎng)初期，菌球處于遲滯期，還原糖含量下降不明顯，從第10天開始，逐漸降低；隨菌球生長(zhǎng)加快，16天后顯著下降（<0.05）（圖8）。

圖8 不同菌齡的菌絲體生物量及培養(yǎng)液還原糖含量

（4）菌絲生長(zhǎng)速度及菌落白度。繡球菌液體菌種培養(yǎng)至第8天接種，菌絲生長(zhǎng)速度最快；隨后

逐漸減慢，但無顯著性差異（>0.05）；12天之后接種，生長(zhǎng)速度顯著下降（<0.05）（圖9）。

菌落白度以液體菌種培養(yǎng)6～12天接種的較高，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速度，說明該菌齡菌種菌球活力強(qiáng)（圖9，圖10）。菌齡12天以上的，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌球活力下降，接種后的菌落白度顯著降低。

3 結(jié)論與問題討論

液體菌種具有生產(chǎn)成本低、培養(yǎng)周期短、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[13]。前期研究結(jié)果[11]表明：采用常規(guī)液體培養(yǎng)方法，培養(yǎng)第6天時(shí)菌球直徑最?。?.20 mm），但此時(shí)菌球密度較低（9.56 個(gè)/mL）；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌球密度最高也僅52.3個(gè)/mL，作為菌種使用，接種后菌絲萌發(fā)點(diǎn)仍然偏少。對(duì)菌種進(jìn)行勻漿可有效增加菌球密度，且接種后菌絲生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高且穩(wěn)定，這在金針菇、杏鮑菇、真姬菇中已有報(bào)道[14, 15]。為使勻漿前獲得較高的菌絲生物量，本試驗(yàn)對(duì)繡球菌液體菌種培養(yǎng)條件予以優(yōu)化。

圖9 不同菌齡液體菌種接種后菌絲生長(zhǎng)速度及菌落白度

圖10 不同菌齡液體菌種接種后的菌絲生長(zhǎng)情況

刁文濤等研究認(rèn)為，繡球菌液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基最佳pH為3.5[16]，楊麗莉[17]與陳博文等[10]則認(rèn)為最適pH在4～5。本試驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)果類似：當(dāng)液體培養(yǎng)基初始pH為5.5時(shí)，菌球密度最高，但pH為4.0時(shí)菌絲體生物量最大（5.45±0.07 g/L）。

以250 mL三角瓶進(jìn)行液體培養(yǎng)，劉成榮等[18]認(rèn)為適宜的裝液量為150 mL，楊麗莉[17]則認(rèn)為裝液量為110 mL時(shí)，菌絲生物量最大（5 g/L）。本試驗(yàn)得出的適宜裝液量為170 mL，與已有研究結(jié)果有較大差異。原因可能是培養(yǎng)基配方不同使培養(yǎng)基滲透壓存在差異，進(jìn)而影響培養(yǎng)基溶解氧含量和菌絲生長(zhǎng)速度。

搖床轉(zhuǎn)速主要影響培養(yǎng)基剪切力和溶解氧含量，高轉(zhuǎn)速有利于菌球增多。本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)，菌球密度可達(dá)78.0±8.5個(gè)/mL。已有研究結(jié)果顯示，搖床轉(zhuǎn)速在110～200 r/min之間時(shí)，菌絲生物量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)[17, 18]。但本試驗(yàn)在120～210 r/min范圍內(nèi)，菌絲生物量隨轉(zhuǎn)速增大呈降低趨勢(shì)。

繡球菌適宜在偏酸性條件下生長(zhǎng)，液體培養(yǎng)條件與金針菇[19, 20]、杏鮑菇[21]、真姬菇[22, 23]、靈芝[24]，江西蟲草[25]等類似。繡球菌液體菌種培養(yǎng)6天后，培養(yǎng)液pH顯著下降，至第10天降至3.89，此后下降趨勢(shì)變緩。說明第6～10天，菌絲生長(zhǎng)旺盛，酸性代謝物開始積累，這從菌球直徑和菌球密度的變化上也能看出。

食用菌菌絲生物量可在一定程度上作為培養(yǎng)終點(diǎn)的判斷指標(biāo)，如真姬菇[23]、金針菇[26]、杏鮑菇[27]、草菇[28]等液體菌種培養(yǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，繡球菌液體菌種培養(yǎng)當(dāng)菌絲體生物量達(dá)到最大時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速度和菌落白度卻顯著（<0.05）降低，說明此時(shí)菌球活力已經(jīng)下降。因此，要獲得活力強(qiáng)的液體菌種，就須將培養(yǎng)終點(diǎn)提前。

綜合考慮菌絲體生物量與菌球活力，宜選擇接種后9～10天作為液體菌種培養(yǎng)終點(diǎn)，此時(shí)菌球直徑1.07±0.03 mm/個(gè)，菌球密度111±11.53 個(gè)/mL，接種后菌絲生長(zhǎng)速度2.34±0.18 mm/d。

本研究結(jié)果獲得的繡球菌液體菌種菌球密度大、直徑小、活力強(qiáng)，可為液體菌種應(yīng)用于繡球菌工廠化栽培提供重要參考，并可為繡球菌液體菌種的質(zhì)量控制提供借鑒。

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Optimization of culture conditions of liquid spawn of

Ma Lu Yang Chi Xiao Donglai Ying Zhenghe Jiang Xiaoling Liu Xiaoyu Lin Yanquan*

(Institute of Edible Fungi, Fujian Academy of Agricultural Sciences, National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding & Cultivation of Featured Edible Fungi, Fuzhou, Fujian 350014, China)

Liquid spawn could reduce the spawn running time and allows the antomation of inoculaton, which is crucial for industrial large scale production. In order to obtain liquid spawn ofwith high density, small diameter and more vigorous mycelium pellet, the culture conditions and its terminal points were optimized. The optimal culture conditions for maximum biomass production were listed as follows: initial medium pH 4.0, liquid volume 140～170 mL, inoculation volume 9% and rotation speed 120～150 r/min. The terminal point of liquid spawn culture is 9～10 days after inoculation, under this conditon, pellet diameter is 1.07±0.03 mm, pellet density is 111±11.53 pellets/mL and mycelial growth rate is 2.34±0.18 mm/d. the results obtained in this work will be beneficial for commercial cultivation of.

liquid culture; culture conditions; terminal point of cultivation; mycelial activity

S646

B

2095-0934（2020）06-428-06

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2018R1020-4、2018R1020-3）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（STIT2017-1-6）；福建省科技特派員后補(bǔ)助項(xiàng)目繡球菌工廠化栽培技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)建設(shè)

馬璐（1984—），男，碩士，主要研究方向?yàn)槭乘幱镁S化栽培。E-mail：malujj@163.com。

林衍銓（1963—），男，研究員，主要從事食用菌育種與工廠化栽培的研究與開發(fā)，E-mail：lyq-406@163.com。