汪林翠，林瓊

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

自噬通過(guò)自噬體包裹自噬底物并轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[1-2]。在應(yīng)激條件下，如饑餓[3]、缺氧[4]、氧化[5]或抗癌藥物治療[6]等，細(xì)胞內(nèi)自噬被激活，以消除應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的損害[7]。自噬失調(diào)與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂以及癌癥等[8]。

微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)是自噬體的重要構(gòu)成蛋白，與其結(jié)合是鑒別細(xì)胞內(nèi)自噬調(diào)節(jié)蛋白的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[9]。核受體輔活化蛋白7(nuclear receptor co-activator 7，NCOA7)能輔助激活核受體，可能是一個(gè)自噬調(diào)節(jié)蛋白[10]，但它與LC3的相互作用及結(jié)合位點(diǎn)仍不清楚。本研究以NCOA7蛋白為研究對(duì)象，探討其與自噬蛋白LC3的相互作用及作用位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

人腎上皮HEK293細(xì)胞，人胃癌AGS細(xì)胞，pCDNA3-Myc-NCOA7質(zhì)粒、表達(dá)LC3與谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)融合蛋白(GST-LC3)的菌液與pGEX-4T-LC3(GST-LC3)質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，AGS細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 抗體和試劑

鼠抗人Myc標(biāo)簽抗體與異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均為鎮(zhèn)江新津生物有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(上海生工生物有限公司)；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SpeⅠ與NotⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA連接酶與DH5α大腸埃希菌感受態(tài)均為鎮(zhèn)江ABM生物公司產(chǎn)品；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；ECL曝光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒與PCR產(chǎn)物純化試劑盒均為上海生工生物有限公司產(chǎn)品；谷胱甘肽(glutathione，GSH)瓊脂凝珠(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液與F12K完全培養(yǎng)液均為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品。

1.3 質(zhì)譜分析胃癌AGS細(xì)胞中的LC3結(jié)合蛋白

將GST-LC3融合蛋白親和固化在GSH標(biāo)記的瓊脂凝珠上，獲得GST-LC3瓊脂凝珠，同時(shí)用GST瓊脂凝珠作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分為4組：GSH瓊脂凝珠與AGS全細(xì)胞裂解液孵育作為空載對(duì)照組(GSH+WCL)；GST-LC3瓊脂凝珠與哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解液孵育作為緩沖液對(duì)照組(GST-LC3+buffer)；GST瓊脂凝珠與AGS全細(xì)胞裂解液孵育為融合蛋白對(duì)照組(GST+WCL)；GST-LC3瓊脂凝珠與AGS全細(xì)胞裂解液孵育作為實(shí)驗(yàn)組(GST-LC3+WCL)；分別孵育3～5 h。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解液清洗3遍，100 ℃煮沸10 min，離心取上清液。上清蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后獲得特異性目的條帶，質(zhì)譜分析由北京博奧晶典有限公司提供技術(shù)支持。

1.4 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCOA7與LC3間相互作用

在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc-NCOA7質(zhì)粒，48 h后提取細(xì)胞蛋白；與此同時(shí)，純化GST(對(duì)照)和GST-LC3細(xì)菌融合蛋白。將表達(dá)GST與GST-LC3融合蛋白的菌液分別擴(kuò)增12～16 h，用0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)3 h。超聲裂解細(xì)菌后，12 000 r/min離心15 min，獲得融合蛋白上清液。將GSH標(biāo)記的瓊脂凝珠分別與GST和GST-LC3融合蛋白上清液共同孵育3～5 h，制備成GST和GST-LC3親和的瓊脂凝珠。將GST和GST-LC3瓊脂凝珠分別與轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc-NCOA7的細(xì)胞蛋白共同孵育3～5 h。用細(xì)胞裂解液清洗瓊脂凝珠，去除未結(jié)合的細(xì)胞蛋白。瓊脂凝珠100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，制成樣本，經(jīng)SDS-PAGE分離。GST與GST-LC3融合蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色。半干電轉(zhuǎn)印法將其余蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%牛血清白蛋白溶液37 ℃封閉1 h。加1 ∶3 000稀釋的鼠抗人Myc標(biāo)簽一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，10 min/次；加HRP羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；ECL熒光顯色，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.5 分子克隆法構(gòu)建NCOA7截短體及點(diǎn)突變體

從NCBI網(wǎng)站上查詢(xún)NCOA7蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，利用Chromas軟件分析NCOA7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)研究目的確定氨基酸截短位點(diǎn)及點(diǎn)突變位點(diǎn)(通常截短位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角)。用DNA Star軟件中的SeqBuilder程序?qū)ふ医囟涛稽c(diǎn)或點(diǎn)突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基位置，以此堿基為起點(diǎn)或終點(diǎn)，根據(jù)互補(bǔ)配對(duì)原則，設(shè)計(jì)18～24 bp的引物序列，同時(shí)需添加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)。

NCOA7全長(zhǎng)包含942個(gè)氨基酸，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：細(xì)胞溶解酶結(jié)構(gòu)域(lysin motif，LysM)、雌激素受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(estrogen receptor binding domain，ERbd)和TBC結(jié)構(gòu)域催化結(jié)構(gòu)域(TBC domain catalytic domain，TLDc)。WXX(L、I、V，W：色氨酸，L：亮氨酸，I：異亮氨酸，V：纈氨酸，X：任意氨基酸)是已知的LC3結(jié)合基序(LC3 interactive region，LIR)。NCOA7蛋白中含有3個(gè)潛在的LIR，分別為310～313位WEDL、692～695位WFAV和747～750位WEII。構(gòu)建NCOA7截短體及點(diǎn)突變體克隆，截短體包括ΔN105(106～942 aa)、N106- 460(106～460 aa)、N460(1～460 aa)、C721-942(721～942 aa)、ΔN462(463～942 aa)、ΔN650(650～942 aa)和ΔN650-I749/750A(650～942 aa)；點(diǎn)突變體包括L313A(313位亮氨酸突變?yōu)楸彼?和I749/750A(749和750位異亮氨酸突變?yōu)楸彼?。NCOA7截短體和點(diǎn)突變體的設(shè)計(jì)模式圖見(jiàn)圖1。PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成。以pCDNA3-Myc-NCOA7質(zhì)粒為模板，每個(gè)突變體克隆分別用相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，用相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切，同時(shí)酶切pCDNA3-Myc載體，膠回收。用T4DNA連接酶將酶切PCR片段與酶切載體相連，構(gòu)成完整質(zhì)粒。用DH5α大腸埃希菌感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐抗性的LB細(xì)菌培養(yǎng)板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落用氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增，菌液行PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌液提取質(zhì)粒DNA，由上海生工生物有限公司測(cè)序，所用引物序列見(jiàn)表1。

圖1 NCOA7不同截短體及點(diǎn)突變體模式圖

表1 引物序列

1.6 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCOA7截短體、點(diǎn)突變體及其N(xiāo)端截短體及突變體與LC3間相互作用

1.6.1 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCOA7截短體及點(diǎn)突變體與LC3間相互作用 利用“1.5”構(gòu)建的ΔN105，N106-460，N460及C721-942截短體及L313A，I749/750A點(diǎn)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc-NCOA7野生型質(zhì)粒(WT)作為陽(yáng)性對(duì)照，48 h后收取細(xì)胞蛋白。純化GST和GST-LC3細(xì)菌融合蛋白(方法同“1.4”)。GST瓊脂凝珠與WT共同孵育(GST+WT)作為陰性對(duì)照組，GST-LC3瓊脂凝珠與WT共同孵育作為陽(yáng)性對(duì)照組(GST-LC3+WT)。GST-LC3瓊脂凝珠分別與轉(zhuǎn)染ΔN105，N106-460，N460，C721-942，L313A，I749/750A的HEK293細(xì)胞蛋白孵育作為實(shí)驗(yàn)組。孵育3～5 h，用細(xì)胞裂解液清洗GST與GST-LC3瓊脂凝珠，去除未結(jié)合的細(xì)胞蛋白。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與“1.4”相同。

1.6.2 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCOA7 N端截短體與LC3間相互作用 利用“1.5”構(gòu)建的NCOA7 N端截短體ΔN462、ΔN650、C721-942及ΔN650-I749/750A轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc-NCOA7質(zhì)粒(WT)作為陽(yáng)性對(duì)照，48 h后收取細(xì)胞蛋白。用GST-LC3瓊脂凝珠分別與此三者細(xì)胞蛋白共同孵育。孵育3～5 h，用細(xì)胞裂解液清洗GST-LC3瓊脂凝珠，去除未結(jié)合的細(xì)胞蛋白。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與“1.4”相同。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)NCOA7截短體的蛋白表達(dá)水平

將HEK293細(xì)胞分為4組，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染pCDNA3質(zhì)粒，陽(yáng)性對(duì)照組轉(zhuǎn)染PCDNA3-Myc-NCOA7質(zhì)粒，溶酶體抑制劑氯喹處理組和蛋白酶體抑制劑萬(wàn)科處理組分別轉(zhuǎn)染NCOA7截短體ΔN462，ΔN650，ΔN650-I749/750A質(zhì)粒。36 h后，氯喹處理組加入氯喹(50 μmol/L)處理12 h，萬(wàn)科處理組加入萬(wàn)科(10 μmol/L)處理12 h。每組均加入哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解液，4 ℃搖床裂解30 min；12 000 r/min，4 ℃離心15 min；取上清液煮沸變性；SDS-PAGE分離蛋白，100 V 2.5 h；半干電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，400 mA 2 h；1%牛血清白蛋白溶液37 ℃封閉1 h；4 ℃過(guò)夜孵育鼠抗人Myc標(biāo)簽一抗(1 ∶3 000)；次日，TBST清洗3遍；HRP羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)孵育2 h；TBST清洗3遍；用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定胃癌AGS細(xì)胞中LC3相互作用蛋白

GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空載對(duì)照組(GSH+WCL)中40 000以上未出現(xiàn)蛋白條帶。緩沖液對(duì)照組(GST-LC3+buffer)與融合蛋白對(duì)照組(GST+WCL)中出現(xiàn)非特異性蛋白。實(shí)驗(yàn)組(GST-LC3+WCL)與3組對(duì)照組相比，在170 000、100 000及約60 000處出現(xiàn)特異性蛋白。對(duì)特異蛋白行質(zhì)譜分析，結(jié)果中含NCOA7(質(zhì)譜結(jié)果未顯示)。見(jiàn)圖2。

黑色箭頭示特異性蛋白位置圖2 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGS細(xì)胞蛋白

2.2 NCOA7與LC3相互作用

GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與GST對(duì)照組比較，GST-LC3實(shí)驗(yàn)組從細(xì)胞裂解液中沉淀出NCOA7蛋白?？捡R斯亮藍(lán)染色顯示，GST與GST-LC3融合蛋白表達(dá)水平基本一致，見(jiàn)圖3。

圖3 GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NCOA7與LC3相互作用

2.3 NCOA7與LC3相互作用位點(diǎn)位于WEDL基序

GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ΔN105、N106-460、N460、C721-942截短體及I749/750A點(diǎn)突變體均能被GST-LC3融合蛋白沉淀，且C721-942蛋白的沉淀程度明顯高于其他突變體。但是，點(diǎn)突變體L313A未被GST-LC3融合蛋白沉淀。在HEK293全細(xì)胞裂解液中，截短體及點(diǎn)突變體蛋白表達(dá)水平一致?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，樣本中GST與GST-LC3融合蛋白表達(dá)水平一致。見(jiàn)圖4。

圖4 NCOA7突變體與LC3相互作用

2.4 NCOA7截短體蛋白表達(dá)受蛋白酶體抑制

免疫印跡結(jié)果顯示，在55 000處對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)非特異性背景條帶。氯喹處理組3個(gè)截短體質(zhì)粒ΔN462，ΔN650，ΔN650-I749/750A未有蛋白表達(dá)。萬(wàn)科處理組3個(gè)截短體質(zhì)粒有蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖5。

圖5 免疫印跡法檢測(cè)截短體的表達(dá)水平

2.5 NCOA7蛋白的651～720氨基酸結(jié)構(gòu)抑制其羧基末端LIR

GST-LC3沉淀結(jié)果顯示，ΔN462和ΔN650-I749/750A未被GST-LC3沉淀，而ΔN650和C721-942能被GST-LC3沉淀，且C721-942沉淀程度明顯高于ΔN650。考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，樣本中GST-LC3融合蛋白表達(dá)量基本一致。見(jiàn)圖6。

圖6 NCOA7 N端截短體與LC3相互作用情況

3 討論

自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，自噬調(diào)節(jié)蛋白使自噬底物具有特異性[11]。已有研究通過(guò)對(duì)人類(lèi)自噬相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)NCOA7存在于自噬網(wǎng)絡(luò)[10]，但并未進(jìn)行具體分析。以往關(guān)于NCOA7蛋白的研究主要集中于其輔助核受體激活的功能[12]，而對(duì)于其作為自噬相關(guān)蛋白的功能并未涉及。本研究主要以HEK293細(xì)胞表達(dá)為手段，結(jié)合GST-LC3沉淀技術(shù)檢測(cè)NCOA7與自噬體蛋白LC3間的相互作用；結(jié)果顯示，NCOA7蛋白被GST-LC3融合蛋白沉淀，表明NCOA7與LC3之間存在相互作用，NCOA7是自噬相關(guān)蛋白。

自噬相關(guān)蛋白均包含至少一段LIR，通過(guò)與LC3相互作用將底物運(yùn)送至溶酶體中消化降解[13-14]。本研究中NCOA7蛋白包含3段潛在LIR，然而其與LC3結(jié)合的基序尚不清楚。NCOA7截短體的GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ΔN105，N106-460，N460均被GST-LC3融合蛋白沉淀，此三者均包含310～313位WEDL基序，表明WEDL是NCOA7與LC3結(jié)合的位點(diǎn)。C721-942被GST-LC3沉淀，說(shuō)明其包含的747～750位WEII基序是與LC3結(jié)合的位置。此外，為避免截短對(duì)蛋白功能的影響，用GST-LC3融合蛋白沉淀點(diǎn)突變體L313A與I749/750A。突變體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L313A不被沉淀，但I(xiàn)749/750A被沉淀，說(shuō)明310～313位WEDL基序確實(shí)是有功能的LIR，但747～750位WEII基序受分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)的降解途徑主要有兩種，溶酶體途徑和蛋白酶體途徑[15-16]。本研究中，ΔN462，ΔN650與ΔN650-I749/750A截短體質(zhì)粒構(gòu)建后，在HEK293細(xì)胞中并不表達(dá)(結(jié)果在文中未給出)，故分別用溶酶體抑制劑氯喹或蛋白酶體抑制劑萬(wàn)科處理。蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，三個(gè)截短體蛋白在氯喹處理組中未檢測(cè)出，但萬(wàn)科處理組均檢測(cè)出，提示NCOA7截短體可能通過(guò)蛋白酶體途徑降解。ΔN462，ΔN650，C721-942與ΔN650-I749/750A截短體的GST-LC3沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ΔN462未被沉淀；ΔN650被沉淀但沉淀的蛋白較少，表明其與LC3結(jié)合較弱；C721-942被沉淀且沉淀的蛋白較多，表明其與LC3結(jié)合較強(qiáng)，說(shuō)明調(diào)節(jié)747～750位LIR的結(jié)構(gòu)位于651～720位氨基酸內(nèi)。ΔN650-I749/750A不能被GST-LC3沉淀，表明692～695位WFAV基序不具有LIR功能。

綜上，本研究結(jié)果表明NCOA7的N端WEDL基序和C端WEII基序是LC3的結(jié)合位點(diǎn)，但在正常情況下，NCOA7 651～720氨基酸區(qū)域內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)抑制其C端WEII基序的功能。由此顯示NCOA7很可能是一個(gè)自噬調(diào)節(jié)蛋白。