楊永剛 李慶杰 張澤鵬 劉揚(yáng)揚(yáng)

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130000；2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心；3長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科研辦公室)

近年來，2 型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者顯著增高，超過76%的T2DM 患者患有NAFLD〔1〕，而NAFLD 患者T2DM 或空腹血糖損害的發(fā)生率高達(dá)18%～33%〔2〕。T2DM與NAFLD可相互促進(jìn)，并形成惡性循環(huán)，從而加速疾病進(jìn)展〔3〕。NAFLD 致使T2DM 患者大血管和微血管并發(fā)癥患病率顯著增加〔4〕，二者并存導(dǎo)致內(nèi)分泌代謝紊亂加重、心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)及全因死亡或肝病相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加〔5〕。

肝脂溶顆粒是長春中醫(yī)藥大學(xué)終身教授劉鐵軍在其導(dǎo)師全國首屆國醫(yī)大師任繼學(xué)教授的指導(dǎo)下創(chuàng)立的治療NAFLD的經(jīng)驗(yàn)方，自1996 年作為院內(nèi)制劑應(yīng)用20余年，經(jīng)過410例臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，肝脂溶顆粒對肝功能、血脂、血糖等多項(xiàng)指標(biāo)均有改善作用。本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物整體角度來探究肝脂溶顆粒治療T2DM合并NAFLD的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1肝脂溶顆粒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究 整理肝脂溶顆粒及肝脂溶顆粒各組方藥材化學(xué)成分，建立肝脂溶顆?；瘜W(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，并通過UHPLC-Q-TOF/MS 對肝脂溶顆粒提取物中化學(xué)成分的鑒別。根據(jù)已明確的肝脂溶顆?；瘜W(xué)物質(zhì)組，構(gòu)建肝脂溶顆粒小分子化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。在已知數(shù)據(jù)庫中查詢NAFLD、胰島素抵抗等靶點(diǎn)，篩選與肝脂溶顆粒相關(guān)的作用靶點(diǎn)，構(gòu)建肝脂溶顆?！俺煞?靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行分析。

1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn) ①藥品與試劑：肝脂溶顆粒(由黃芪、葛根、澤瀉、丹參、大黃等組成)，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，人肝癌細(xì)胞(HepG2)細(xì)胞株購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，胰島素(Sigma 公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(Gibco公司)，葡萄糖氧化酶檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，葡萄糖激酶(GCK)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司)，總蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(上海碧云天公司)，余試劑為分析純。②細(xì)胞培養(yǎng)及胰島素抵抗模型：將 Hep G2 細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含1%的青霉素和 鏈霉素)中，在 37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將 Hep G2 細(xì)胞置于含1×10-7mol/L胰島素(實(shí)驗(yàn)組)誘導(dǎo)36 h〔6〕。③細(xì)胞存活率檢測:選取不同濃度的藥物(0、5、10、20、40、80、120、160、200、240 μg/ml)處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。④實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)：實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、肝脂溶顆粒低濃度組、肝脂溶顆粒高濃度組。將 HepG2 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基接種于 96 孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，將培養(yǎng)基吸出換上含0.2% BSA的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，12 h后即細(xì)胞適應(yīng)無血清的環(huán)境后再將培養(yǎng)基移出。正常組加入0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基；模型組加入含胰島素濃度 10-6mol/L，0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；待胰島素抵抗模型建立后，于模型組換上無胰島素 0.2%BSA培養(yǎng)基，給藥組分別在模型組的基礎(chǔ)上給予肝脂溶顆粒20、80 μg/ml干預(yù)36 h。⑤葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)：將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，吸取培養(yǎng)液用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，用空白孔中的葡萄糖含量減去其余各孔的葡萄糖含量即為各孔36 h的葡萄糖消耗量(GC)。葡萄糖消耗檢測完畢后，用每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490 nm下測定各孔吸光度(OD)值，以監(jiān)測細(xì)胞的數(shù)目與活力通過計(jì)算 GC/MTT 可以消除細(xì)胞增殖對培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的誤差。⑥FOXO1 表達(dá)檢測:選用低濃度20 μg/ml和高濃度80 μg/ml肝脂溶顆粒藥物處理細(xì)胞24 h，隨后收取細(xì)胞進(jìn)行Western印跡檢測FOXO1蛋白水平及rt-qPCR檢測FOXO1轉(zhuǎn)錄水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1通過檢索中醫(yī)藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(TCMSP/TCMID/TCM Database@Taiwan)，建立本方成分?jǐn)?shù)據(jù)庫 應(yīng)用IPA、OMIM、NCBI等數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點(diǎn)，并建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用DAVID完成主要功能靶點(diǎn)預(yù)測，建立成分與靶點(diǎn)之間的預(yù)測關(guān)系，通過Omicshare平臺，完成預(yù)測通路的富集分析高級氣泡圖。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果推測肝脂溶顆粒治療T2DM合并NAFLD的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控FOXO通路中41個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。見圖1～3。

圖1 高級氣泡圖顯示肝脂溶顆粒的潛在KEGG通路，前30項(xiàng)潛在通路

圖2 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的靶點(diǎn)預(yù)測及富集分析得出肝脂溶顆粒對FOX信號通路具有調(diào)控作用

圖3 肝脂溶顆粒的疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2肝脂溶顆粒不同處理時(shí)間對 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量隨肝脂溶顆粒時(shí)間增加而降低。肝脂溶顆粒作用于HepG2細(xì)胞的最佳時(shí)間點(diǎn)為24 h。見表1。

表1 不同濃度胰島素作用不同時(shí)間人源肝癌HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量

2.3MTT法檢測肝脂溶顆粒對HepG2細(xì)胞的毒性作用 0～80 μg/ml的藥物濃度對細(xì)胞的毒性較小。因此選用低濃度20 μg/ml和高濃度80 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖4。

圖4 不同濃度肝脂溶顆粒對HepG2細(xì)胞的毒性作用

2.4肝脂溶顆粒藥物調(diào)控胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝入量 對照組葡萄糖消耗量為0.104±0.099，模型組為0.536±0.042，肝脂溶顆粒低濃度組為0.733±0.057，高濃度組為0.816±0.077；藥物處理組一定程度上緩解了胰島素抵抗模型組的葡萄糖攝入水平。

2.5肝脂溶顆粒藥物通過FOXO1調(diào)控HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝 FOXO1 mRNA水平在模型組和藥物處理組中都沒有變化。但其蛋白水平在模型組中高表達(dá)，藥物處理后表達(dá)下調(diào)。推測肝脂溶顆粒通過翻譯后途經(jīng)調(diào)控FOXO1的蛋白水平調(diào)控肝臟中糖原合成，進(jìn)而調(diào)控葡萄糖代謝從而治療糖尿病。見圖5。通過軟件分析FOXO1免疫印跡的光密度值，證明加藥處理后細(xì)胞內(nèi)FOXO1的表達(dá)量上升20%。

圖5 肝脂溶顆粒通過翻譯后修飾途徑調(diào)控FOXO1的蛋白水平

3 討 論

脂肪肝從中醫(yī)角度認(rèn)為是全身的津液輸布、運(yùn)化失常，與人的先天稟賦、體質(zhì)及后天調(diào)攝不當(dāng)有關(guān)，肝郁脾虛、痰濕內(nèi)聚、化為肥膏，屬于氣血津液病范疇，乃本虛表實(shí)之病，以肝郁脾虛為本，濕、熱、瘀、積為標(biāo)，最終形成“脂毒”。遵循《素問至真要大論》“堅(jiān)者消之”、“結(jié)者散之”、“逸者行之”、“衰者補(bǔ)之”的法則，強(qiáng)調(diào)肝脾同調(diào)、濕熱瘀積同治，而從濕、熱、瘀、積論治NAFLD，以清熱利濕、化瘀消積為基本治法〔7,8〕。在上述治法的基礎(chǔ)上，獨(dú)創(chuàng)性的根據(jù)“六腑以通為用”經(jīng)典理論及吳又可“逐邪勿拘結(jié)糞”學(xué)說，將中醫(yī)下法與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸肝循環(huán)理論結(jié)合，體現(xiàn)了傳統(tǒng)繼承觀與時(shí)代發(fā)展觀相結(jié)合的鮮明特點(diǎn)，將毒性物質(zhì)(脂毒等)從腸道排除，切斷腸肝循環(huán)，改善糖脂代謝、炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕或控制肝病的發(fā)展〔9〕。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是理解中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用的科學(xué)方法〔10〕。其結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科技術(shù)，與中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用特征相吻合，在深入揭示中藥作用機(jī)制的研究中已經(jīng)越來越受到研究者的重視〔11,12〕。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法與中醫(yī)藥的思維有相同之處，因此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于研究中醫(yī)藥的機(jī)制具有一定優(yōu)勢。肝脂溶顆粒的主要組成包括黃芪、葛根、大黃、澤瀉、丹參等。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)黃芪、葛根、大黃等都具有降低血糖、改善胰島素抵抗的作用。FOXO1是肝臟監(jiān)測血液中胰島素水平與糖脂代謝的傳感器〔13〕。FOXO1廣泛參與調(diào)控β細(xì)胞的增殖、分化、自噬及線粒體功能等多種信號通路的調(diào)控，在胰島細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要作用〔14〕。T2DM主要的發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗，是靶器官如肝臟、肌肉及脂肪等對胰島素的敏感性下降。肝臟是糖代謝的核心器官，能通過糖異生作用調(diào)節(jié)血糖輸出，肝臟糖異生紊亂導(dǎo)致的肝糖輸出增多是肝臟胰島素抵抗發(fā)生的重要誘因〔15〕。研究表明，胰島素抵抗在NAFLD 發(fā)展中起重要作用，胰島素抵抗被認(rèn)為是NAFLD 的首要癥狀〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果中可以看出肝脂溶顆粒治療T2DM合并NAFLD的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控FOXO通路中41個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。在細(xì)胞試驗(yàn)中證實(shí)FOXO1的表達(dá)量與細(xì)胞對胰島素的敏感性存在規(guī)律性的負(fù)相關(guān)。在發(fā)生胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞里，F(xiàn)OXO1 基因及蛋白表達(dá)均顯著增加。因此，肝脂溶顆粒治療T2DM合并NAFLD是通過調(diào)控FOXO1蛋白而實(shí)現(xiàn)的，這也為中藥治療T2DM 合并NAFLD 提供新思路。