李少麗，李來好，楊賢慶，鄧建朝*，陳勝軍，李春生，胡曉，戚勃

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

大眼金槍魚(Thunnusobesus) 又名肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋和太平洋等海域[1-3]。金槍魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，不僅富含蛋白質(zhì)，還含有大量的DHA和EPA等不飽和脂肪酸[4]，食用和商用價值極高。據(jù)最新國際漁業(yè)動態(tài)報道[5],金槍魚類市場不僅魚價指數(shù)近年來持續(xù)增長，捕撈水平也在持續(xù)升高。

金槍魚的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量極高[4]，因此金槍魚在存放過程中極易出現(xiàn)腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象。目前對金槍魚新鮮度的判斷，主要集中在pH值、TVB-N、菌落總數(shù)以及K值等鮮度指標。但在金槍魚腐敗過程中，生物胺也對魚肉品質(zhì)產(chǎn)生了極大影響，甚至還會引起食物中毒，一些國家已經(jīng)制定了生物胺限定標準。因此，對金槍魚新鮮度的判斷，應將其考慮在內(nèi)。

近年來，電商的迅速發(fā)展使線上購買金槍魚成為可能，但在流通過程中，金槍魚的貯藏溫度往往得不到有效控制，有時甚至接近室溫，其品質(zhì)保障存在一定隱患。為研究大眼金槍魚在網(wǎng)購流通過程中的品質(zhì)變化，研究選取了0、4、15和25 ℃作為流通條件來測定大眼金槍魚在運輸過程中的鮮度指標和8種生物胺在不同溫度下的變化規(guī)律，最后將鮮度指標和生物胺之間的相關(guān)性進行了系統(tǒng)分析和回歸方程分析，得出各溫度下的最優(yōu)貨架期，以期為網(wǎng)購流通過程中大眼金槍魚的保鮮和品質(zhì)保障提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚，購自廣州金槍魚專賣店。所購金槍魚由廣州市沛洋食品有限公司于2019年6月捕撈于太平洋近海，船上屠宰冷凍后直接抽真空凍藏于-60 ℃條件下，通過背景生物胺的檢測，初始狀態(tài)組胺濃度為“未檢出”。將買回的大眼金槍魚在無菌環(huán)境下等質(zhì)量切割，分裝在自封袋中(該過程在超凈工作臺進行，提前將工具進行30 min紫外滅菌)。

色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺及丹磺酰氯(純度≥98 %)，購自美國Sigma公司。高氯酸、鹽酸、丙酮、甲基紅及碳酸氫鈉等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。瓊脂培養(yǎng)基購自廣州市普博儀器有限公司。乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購自上海安譜實驗科技股份有限公司。超純水為實驗室自制。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100液相色譜儀(美國 Agilent 公司)；TDZ5-WS臺式低速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；MILLI-Q超純水機(美國Millipore公司)；超高能量研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司)；PB-10精密pH測試儀(德國Sartorius公司)；全自動凱氏定氮儀(丹麥FOSS公司)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；0.22 μm針頭微孔濾膜一次性過濾器(天津市精拓儀器科技有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(上海新苗醫(yī)療器械有限公司)；FJ-200高速分散均質(zhì)機(上海標本模型廠)；明鑒SPX型智能生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

將分割好的大眼金槍魚魚塊裝入自封袋，為模擬網(wǎng)購流通過程中的貯藏溫度，選取0、4、15和25 ℃條件下貯藏魚肉，分別間隔2d、1d、12h、8h取樣5 g，檢測大眼金槍魚pH值、TVB-N、菌落總數(shù)、K值以及生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺)的含量。

1.3.2 pH值的測定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》[6]對大眼金槍魚魚肉進行測定。

1.3.3 TVB-N的測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[7]，采用自動凱氏定氮儀法進行揮發(fā)性鹽基氮的測定。

1.3.4 菌落總數(shù)的測定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[8]測定菌落總數(shù)。

1.3.5 K值的測定

參考SC/T 3048—2014《魚類鮮度指標K值的測定 高效液相色譜法》進行K值測定[9]，K值計算公式如下：

式(1)

式中：ATP(adenosine triphosphate)為腺苷三磷酸、ADP(adenosine diphosphate)為腺苷二磷酸、AMP(adenosine monophosphate)為腺苷酸、IMP(inosinic acid)為肌苷酸、HxR(inosine)為次黃嘌呤核苷、Hx(hypoxanthine)為次黃嘌呤。各數(shù)據(jù)單位為μmol/g。

1.3.6 生物胺的測定

參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》[10]方法測定，前處理采用經(jīng)優(yōu)化過后的超聲萃取的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理并作圖，采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件進行顯著性和Duncan’s相關(guān)性分析，分析結(jié)果以平均值±標準偏差(X±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下大眼金槍魚pH的變化

pH在一定程度上可以用來評價肉類的新鮮程度[11]，大眼金槍魚肉在0、4、15和25 ℃貯藏期間pH變化如圖1所示。4個溫度條件下貯藏魚肉的pH值變化趨勢相似，呈先下降后上升的趨勢，0 ℃時先下降到5.71，最終上升到6.56；4 ℃時下降到5.99，最終上升到6.36，15 ℃時下降到6.19，最終上升到6.64；25 ℃時下降到6.12，最終上升到6.71。原因在于貯藏初期，魚體內(nèi)的糖原和ATP會分解產(chǎn)生乳酸和磷酸，使魚肉組織的pH下降，酸性增強[12]。而后pH的上升是由于魚體經(jīng)過僵直階段之后，體內(nèi)水解酶(特別是蛋白酶)和細菌的相關(guān)酶[13]會將含氮物質(zhì)分解為氨基酸和低分子量有機堿[14]，同時魚肉的品質(zhì)也在持續(xù)下降。該實驗結(jié)果和Ezati等[15]的研究相似。但僅根據(jù)pH來判斷網(wǎng)購大眼金槍魚可否生食還存在不確定性，需要結(jié)合多個指標來綜合分析判斷。

圖1 不同貯藏溫度下大眼金槍魚pH隨時間的變化趨勢Fig.1 Changes of pH during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.2 不同貯藏溫度下大眼金槍魚TVB-N的變化

貯藏過程中，魚肉中的蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下被降解為氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)，再與有機酸結(jié)合生成揮發(fā)性的鹽基態(tài)氮，TVB-N可作為魚類貯藏初期的鮮度指標[16]。由圖2可知TVB-N的質(zhì)量分數(shù)隨著時間的延長而增加，且溫度越高，增長速度越快，這與微生物的數(shù)量和貯藏的溫度密切相關(guān)[17]。0 ℃貯藏條件下TVB-N的質(zhì)量分數(shù)增長趨勢最為緩慢，貯藏初期的魚肉中微生物含量低，品質(zhì)損失主要是由于自身蛋白酶的作用[18]，隨著貯藏時間的延長，微生物大量繁殖，胞外蛋白酶的數(shù)量增多，在酶的作用下，蛋白質(zhì)被大量分解，TVB-N的質(zhì)量分數(shù)也隨之快速增加，第8天超過了生食金槍魚標準所規(guī)定的250 mg/kg[19]，達到了258.67 mg/kg。隨著溫度的升高，4 ℃條件下在第6天就達到了281.80 mg/kg，15 ℃時在第48 h達到了295.36 mg/kg，25 ℃條件下微生物和酶的活性最高，TVB-N的質(zhì)量分數(shù)增長趨勢最為迅速，32 h就已超出金槍魚生食標準，達到了264.70 mg/kg。由此可知，網(wǎng)購大眼金槍魚在運輸過程中須保證低溫，且盡量縮短運輸時間，從而減少TVB-N的產(chǎn)生，保障魚肉品質(zhì)。

圖2 不同貯藏溫度下大眼金槍魚TVB-N隨時間的變化趨勢Fig.2 Changes of TVB-N during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.3 不同貯藏溫度下大眼金槍魚菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)作為評價水產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的重要指標，在研究水產(chǎn)品鮮度變化時是必不可少的。大眼金槍魚在0、4、15以及25 ℃貯藏條件下貯藏期間菌落總數(shù)的變化如圖3所示。相同溫度下，菌落總數(shù)含量的增長趨勢較為穩(wěn)定，隨著溫度的升高，在相對適宜的環(huán)境中，細菌繁殖速度加快。0 ℃條件下，金槍魚的菌落總數(shù)在第4天超過了生食金槍魚行業(yè)標準所規(guī)定的4.0 lg(CFU/g)，達到了4.91 lg(CFU/g)。4 ℃條件下第2天超標，達到了4.40 lg(CFU/g)。15 ℃和25 ℃條件下，分別在12 h和8 h達到了4.29 lg(CFU/g)和4.30 lg(CFU/g)。

圖3 不同貯藏溫度下大眼金槍魚菌落總數(shù)隨時間的變化趨勢Fig.3 Changes of aerobic plate count during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.4 不同貯藏溫度下大眼金槍魚K值的變化

早在1959年Saito等[20]就認為K值可作為水產(chǎn)品加工原料的鮮度指標，魚類死后，ATP會依次降解為ADP、AMP、IMP、HxR及Hx。大眼金槍魚在不同貯藏溫度和不同時間K值變化趨勢如圖4所示。在0、4、15和25 ℃貯藏條件下，大眼金槍魚K值呈上升趨勢。0 ℃貯藏過程中K值增長速度最為緩慢(3.53%/d，r2=0.99)，在第2天K值超過20%，不能用于制作生魚片[21]。在4 ℃貯藏條件下K值增長速度增高(7.33%/d，r2=0.97)，魚肉可生食期為1天，K值為19.86%。15 ℃條件下K值增長速率明顯加快(20.25%/d，r2=0.99)，可生食期僅為12 h。25 ℃條件下K值增長速率最快(35.48%/d，r2=0.99)，可生食期僅為8 h，K值就超過了20%。該結(jié)果與汪蘭等[21]對鱸(Lateolabraxjaponicus)的研究結(jié)果一致。不同溫度下K值的增長差異說明了溫度影響酶活，進而影響了ATP的降解，因此網(wǎng)購生食金槍魚需要加強其在流通過程中對溫度的控制。

圖4 不同貯藏溫度下大眼金槍魚K值隨時間的變化趨勢Fig.4 Changes of K value during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.5 不同貯藏溫度下大眼金槍魚生物胺的變化

生物胺是具有生物活性的低分子量有機堿，在新鮮魚體中主要是由自身的氨基酸脫羧酶對自身前體氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生[24]，增長緩慢，隨著魚體死亡，魚肉中的微生物大量生長[25]，生物胺的含量增長迅速。由圖5可知，不同貯藏溫度下，生物胺的變化也有所不同。組胺在不同貯藏溫度下均呈增長趨勢且增長速率要遠高于其他生物胺，原因是組氨酸在金槍魚中的含量較高[26]，從而導致組胺生成量較多，0、4、15和25 ℃貯藏過程中，分別在第8天，第4天，第12 h和第8 h超過了SC/T 3117—2006所規(guī)定的90 mg/kg，達到了94.78 mg/kg、136.24 mg/kg、91.98 mg/kg和92.54 mg/kg，不可生食。但根據(jù)Guizani等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，黃鰭金槍魚(Thunnusalbacores)在0 ℃貯藏條件下魚肉中的組胺含量有降低的趨勢，可能是由于魚的種類以及魚肉中存在組胺降解菌的原因[27]，具體因素還需要進一步探究。尸胺、腐胺和酪胺含量的變化與組胺相似，新鮮魚肉中未檢測出尸胺、腐胺和酪胺，隨著大眼金槍魚魚肉腐敗程度的加深, 分別在第4天，第2天，第12 h和第8 h含量迅速增加。色胺的含量在貯藏期間呈下降趨勢，苯乙胺，亞精胺和精胺在貯藏期間含量呈增長趨勢，但這些生物胺的含量變化都不夠明顯，因此判斷組胺、尸胺、腐胺和酪胺為大眼金槍魚中的主要生物胺。

圖5 0 ℃(a)、4 ℃(b)、15 ℃(c)及25 ℃(d)貯藏條件下生物胺質(zhì)量分數(shù)隨時間變化趨勢Fig.5 Changes of the biogenic amine mass fraction under 0 ℃(a), 4℃(b), 15℃(c), and 25℃(d) storage conditions

2.6 相關(guān)性分析

為分析大眼金槍魚貯藏過程中鮮度指標和生物胺質(zhì)量分數(shù)之間的關(guān)系，根據(jù)以上分析結(jié)果，對pH值、TVB-N、菌落總數(shù)、K值、生物胺質(zhì)量分數(shù)、生物胺指數(shù)(biogenic amine index，BAI)以及質(zhì)量指數(shù)(quality index，QI)進行皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)分析，其分析結(jié)果如表1所示。

從表1可知，生物胺質(zhì)量分數(shù)與pH值之間的相關(guān)性不顯著。在不同貯藏溫度下，色胺和TVB-N、菌落總數(shù)以及K值呈負相關(guān)，但在25 ℃時的相關(guān)性不顯著。苯乙胺、亞精胺及精胺和鮮度指標的相關(guān)性不顯著，腐胺、尸胺、組胺和酪胺與鮮度指標的相關(guān)性極顯著(P<0.01)。BAI為組胺、腐胺、尸胺和酪胺的質(zhì)量分數(shù)之和，其與鮮度指標為極顯著相關(guān)(P<0.01)。經(jīng)研究可知，BAI適用于金槍魚新鮮度的評價，以BAI≤50 mg/kg的金槍魚定為魚肉感官品質(zhì)可接受的范圍[28]。QI=(組胺+腐胺+尸胺)/(1+亞精胺+精胺)，最初是用來研究金槍魚罐頭原料的新鮮度，可采用QI作為評價金槍魚新鮮度的指標，但評價標準應同時以其他指標作為參考[29]，總體以小于10為可接受范圍。從相關(guān)性分析可知，BAI和QI結(jié)果相似，與TVB-N、菌落總數(shù)以及K值都有極顯著相關(guān)性(P<0.01)。將BAI以及QI規(guī)定指標與生食金槍魚的行業(yè)標準[19]作對比可知，優(yōu)質(zhì)魚與可食用生鮮魚的標準存在較大的差異，因此，對于金槍魚的生食標準，應該綜合考慮各方面的影響因素。

表1 大眼金槍魚中生物胺與pH值、TVB-N、菌落總數(shù)和K值的相關(guān)性Tab.1 Correlations of biogenic amines with pH Value, TVB-N, aerobic plate count and K Value in bigeye tuna(Thunnus obesus)

2.7 回歸方程分析

為進一步明確鮮度指標和各生物胺之間的關(guān)系，將經(jīng)相關(guān)性分析后得出的顯著相關(guān)指標TVB-N、菌落總數(shù)和K值作為自變量，BAI和QI作為因變量進行回歸分析，建立了不同溫度下各個指標間的相關(guān)性回歸模型(圖6～圖8)。由圖3、圖4和圖5可知，不同溫度下TVB-N、菌落總數(shù)和K值與生物胺指標的的擬合度良好，除15 ℃條件下K值與QI的回歸模型差異顯著(P<0.05)外，其他回歸模型均具有極顯著差異(P<0.01)。從與BAI的回歸系數(shù)看，在該回歸模型下TVB-N與K值之間的回歸性最好，其中TVB-N的∑R2=3.76，菌落總數(shù)的∑R2=3.33，K值的∑R2=3.76。從QI的回歸系數(shù)看，TVB-N的回歸性最好，在該回歸模型下TVB-N的∑R2=3.54，菌落總數(shù)的∑R2=3.39，K值的∑R2=3.45。從BAI與QI的回歸系數(shù)看，不同溫度下BAI要優(yōu)于QI的回歸性，與TVB-N、菌落總數(shù)和K值的關(guān)系更加密切，更適用于對金槍魚的鮮度判斷。

圖6 TVB-N與生物胺指標的回歸模型Fig.6 Regression models between TVB-N and biogenic amines indicator

圖7 微生物數(shù)量與生物胺指標的回歸模型Fig.7 Regression models between microbilogical count and biogenic amines indicator

圖8 K值與生物胺指標的回歸模型Fig.8 Regression models between K value and biogenic amines indicator

3 討論

本研究對模擬網(wǎng)購生食大眼金槍魚不同溫度條件下的pH、TVB-N、菌落總數(shù)、K值和生物胺進行了較為系統(tǒng)的研究，綜合考慮相關(guān)因素，不同溫度下(0、4、15和25 ℃)的生食大眼金槍魚貨架期分別為48、24、12和8 h。實驗結(jié)果顯示，通過pH無法準確判斷大眼金槍魚的新鮮度，隨著溫度的升高和時間的延長，蛋白質(zhì)被相關(guān)酶大量分解[30]，TVB-N、菌落總數(shù)、K值和生物胺質(zhì)量分數(shù)增長迅速，因此溫度和時間是控制魚肉品質(zhì)的關(guān)鍵，保證低溫和降低運輸時間可有效延長生食大眼金槍魚的貨架期。通過相關(guān)性分析，pH與生物胺質(zhì)量分數(shù)并無顯著相關(guān)性，TVB-N、菌落總數(shù)和K值與生物胺具有顯著相關(guān)性。大眼金槍魚的主要生物胺為腐胺、尸胺、組胺和酪胺，BAI以及QI可用來判斷生物胺是否超標，綜合回歸模型結(jié)果可知，BAI比QI更適合作為生食大眼金槍魚的鮮度判斷標準。綜上所述，TVB-N變化敏感度較低，而K值、菌落總數(shù)和生物胺指數(shù)的變化基本一致，因此K值、菌落總數(shù)和生物胺指數(shù)可綜合考慮作為流通過程中生食大眼金槍魚的鮮度判定指標。目前國內(nèi)外對于生食金槍魚各有標準，存在一定差異，因此，對于金槍魚的生食標準，應該綜合考慮影響因素，才能確保消費者食用安全。其次，網(wǎng)購金槍魚在運輸過程中溫度控制不當，往往在0 ℃以上，甚至接近室溫溫度，且運輸時間在1～3 d不等，這些都將成為消費者生食大眼金槍魚的安全隱患。如何在網(wǎng)購流通過程中有效控制溫度，保障魚肉品質(zhì)，還需要進一步深入研究。本研究可為網(wǎng)購生食大眼金槍魚的貯藏運輸以及消費者安全生食提供理論依據(jù)。