楊鑫，石欣，許南，舒鈞

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明）

0 引言

一般而言，外傷所致的脊髓損傷除了脊髓發(fā)生的原發(fā)性創(chuàng)傷外，還會引發(fā)一系列級聯(lián)的繼發(fā)性損傷。其損傷部位由原發(fā)的受損區(qū)域向其頭尾兩端方向不斷擴展。在SCI發(fā)生后，由于缺血及免疫炎癥反應(yīng)等事件的發(fā)生，損傷部位的神經(jīng)元、軸突、少突膠質(zhì)（前體）細胞（OPCs， Oligodendrocyte Precursor Cells）、髓鞘的數(shù)量減少，之后由于以星形膠質(zhì)細胞為主的細胞增殖，纖維瘢痕開始形成，成纖維細胞來源的某些細胞對損傷中心進行填充。在這一過程中，會導(dǎo)致嚴重的運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙，并引發(fā)一系列與此相關(guān)的臨床癥狀，如肢體運動感覺障礙、癱瘓等，以及由此引起的如褥瘡、肺部感染等能夠嚴重影響患者生活及心理健康的并發(fā)癥。目前已有大量的基礎(chǔ)研究表明了細胞移植治療脊髓損傷的有效性，也有許多學(xué)者及骨科醫(yī)師開展了細胞移植修復(fù)脊髓損傷的臨床研究。本文就細胞移植修復(fù)脊髓損傷的機制、目前常用的移植細胞、細胞聯(lián)合移植的配伍方案以及三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)在脊髓損傷修復(fù)中的最新應(yīng)用進展予以綜述。

1 細胞移植修復(fù)SCI的機制

當前細胞移植修復(fù)脊髓損傷的機制中，通常以五個機制最為常見：神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、軸突再生、神經(jīng)傳遞形成、髓鞘再生[1]。移植細胞能夠介導(dǎo)營養(yǎng)因子及細胞因子等生物活性因子分泌，并且通過防止血管損傷、改善損傷區(qū)域血流供應(yīng)來對神經(jīng)進行保護。炎癥反應(yīng)對脊髓損傷的修復(fù)既有有益的一面也有有害的一面，移植細胞可以通過免疫調(diào)節(jié)，減弱有害的炎癥反應(yīng)或刺激有益的炎癥反應(yīng)。同時，由移植細胞組成的“橋”形成，能夠穿過病灶部位，為軸突生長提供基質(zhì)。當移植的細胞能夠分化、成活并且與宿主神經(jīng)元間有軸突生長和形成突觸時，神經(jīng)傳遞則能夠形成。脊髓損傷時，脫髓鞘會破壞傳導(dǎo)，而細胞移植能夠促進髓鞘再生，這被認為可以改善脊髓損傷后的恢復(fù)。目前，細胞移植一直是脊髓損傷治療研究的熱點，有大量研究文獻認為細胞移植對脊髓損傷修復(fù)有效。

2 細胞移植及細胞聯(lián)合移植

2.1 細胞移植

當前被廣泛研究的移植細胞主要包括：施萬細胞（SCs，Schwann Cells），神 經(jīng) 干 細 胞 和 祖 細 胞（NSPCs， Neural Stem/Progenitor Cells），少突細胞前體細胞（OPCs），嗅鞘細胞（OECs，Olfactory EnsheathingCells）和間充質(zhì)干細胞（MSCs， Mesenchymal Stem Cells）。其中： （1）施萬細胞能夠分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子及胞外基質(zhì)蛋白，這對軸突生長起著重要的作用[2]，施萬細胞移植可以對損傷脊髓的周圍組織起到神經(jīng)保護作用，減小病變空腔，并且可以促進軸突生長入病變損傷部位以及促進再生軸突的髓鞘形成。然而其在體外培養(yǎng)純化效率仍較低，但近期也有大量關(guān)于施萬細胞的培養(yǎng)和純化的研究，提供了更加簡單便捷的方法來培養(yǎng)、保存施萬細胞[3]。（2）神經(jīng)干細胞和（或）祖細胞（NSPCs）：具有多分化的潛力，可以在體外分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)前體細胞，移植脊髓神經(jīng)干細胞和（或）祖細胞能促進大鼠脊髓損傷后早期功能恢復(fù)[1]，但其移植后在宿主體內(nèi)存活率較低。（3）少突細胞前體細胞（OPCs）： 是脊髓損傷后替代損傷區(qū)域中少突膠質(zhì)細胞的潛在來源，能夠有潛力分化為有髓鞘的少突膠質(zhì)細胞。其增殖、遷移和分化受到許多因素的影響，如神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子等的影響。也有研究表明OPCs可能在促進膠質(zhì)瘢痕形成過程中發(fā)揮作用，可能會抑制軸突再生[4]。（4）嗅鞘細胞（OECs）：是能夠支持嗅覺感受器軸突生長進入嗅球的一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在脊髓損傷區(qū)域能夠與膠質(zhì)瘢痕發(fā)生相互作用，分泌大量細胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子刺激血管增生、促進軸突生長及髓鞘再生，從而在脊髓損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用[5]。（5）間充質(zhì)干細胞（MSCs）： 具有多分化和免疫調(diào)節(jié)的潛力，主要通過旁分泌[6]的方式調(diào)節(jié)及緩解脊髓損傷區(qū)域的微環(huán)境，有利于神經(jīng)保護、軸突再生及髓鞘形成，Kim等人[7]在急性脊髓損傷的大鼠模型中移植入MSCs，發(fā)現(xiàn)在MSCs移植后，脊髓損傷大鼠模型的I L-1α，CXCL-2，CXCL-10，TNF-α和TGF-β表達降低，結(jié)果表明MSCs移植通過減少炎癥反應(yīng)、促進星形膠質(zhì)細胞增生、減少瘢痕形成，從而改善大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

脊髓損傷修復(fù)的幾個機制不是單一存在的，他們之間有著復(fù)雜而緊密的聯(lián)系。上述幾種類型的細胞，其各有其自己的特點，各有其優(yōu)勢及劣勢。有的細胞 （如MSCs） 具有改善微環(huán)境的作用，然而其移植后分化為神經(jīng)元的能力較低；有的細胞在移植后存活率較低；有的細胞移植后可能會抑制軸突再生。雖然有許多單獨類型細胞移植已經(jīng)在許多研究中被證明對脊髓損傷修復(fù)有效[8-11]，但現(xiàn)在也有許多研究，根據(jù)脊髓損傷后的病理生理學(xué)特點、脊髓修復(fù)機制、各類移植細胞的不同特點、各類細胞的不同來源等方面進行綜合分析考慮后，選擇其中幾類細胞進行聯(lián)合移植，結(jié)果表明可能會帶來更好的治療效果。

2.2 細胞聯(lián)合移植

2.2.1 NSPCs和OECs聯(lián)合移植

NSCs能夠分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)，然而在移植后其在宿主內(nèi)存活率較低，而OECs能夠分泌大量的生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF， Vascular Endothelial Growth Factor）、腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF， Brain Derived Neurotrophic Factor）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF， Glial-cell-line Derived Neurotrophic Factor）、神經(jīng)生長因子（NGF， Nerve Growth Factor）等，這為NSCs移植細胞提供了良好的生長分化微環(huán)境，這兩類細胞聯(lián)合移植，可以增強移植物的生存能力及提高功能恢復(fù)能力。Wang等人及Ao等人的研究[12,13]表明除了NSCs具有分化潛能以外，OECs可以幫助神經(jīng)元軸突穿過膠質(zhì)瘢痕促進脊髓損傷的功能恢復(fù)。NSCs和OECs的聯(lián)合移植優(yōu)于NSCs或OECs的單一移植物。Guo等人[14]應(yīng)用高溫預(yù)處理NSCs及OECs細胞并在脊髓損傷大鼠中進行聯(lián)合移植，結(jié)果能夠使脊髓損傷大鼠的BBB評分迅速增加。

2.2.2 MSCs和NSPCs聯(lián)合移植

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)的能力，康健等[15]闡述了BMSCs具有的免疫調(diào)節(jié)能力，將BMSCs移植入SCI受損部位后能夠減輕該患處的免疫炎癥反應(yīng)。同時，BMSCs能夠分泌大量的營養(yǎng)因子，改善損傷區(qū)域微環(huán)境，增強NSCs的存活能力，改善其功能恢復(fù)。Hosseini等人的研究[16]提示MSCs及NSCs聯(lián)合移植降低了細胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活性，減少了促抗炎細胞因子IL-1β和IL-6。與單獨移植做對比，能夠顯著改善神經(jīng)功能。Stewart等人的研究[17]表明此兩種類型細胞聯(lián)合移植可以增加受損區(qū)域附近的軸突密度，改善模型動物的運動功能。

2.2.3 MSCs和OECs細胞聯(lián)合移植

對于MSCs而言，由于其具有分化為神經(jīng)元以及在體外能快速增殖的能力，MSCs可作為細胞移植療法的“種子細胞”。這些“種子”具有很強的可塑性，可在微環(huán)境中被轉(zhuǎn)化，從而分化為特定的神經(jīng)元來替代受損的神經(jīng)元。OECs可作為也能夠成為一種治療脊髓損傷合理的治療策略[18]。對于OECs而言，由于其具有改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的能力，在MSCs和OECs細胞聯(lián)合移植療法中，可充當“土壤細胞”的作用，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，為受損區(qū)域的神經(jīng)細胞及移植細胞提供良好的微環(huán)境，充當“土壤”的作用。趙廷寶等人的臨床研究中[19]，將自體MSCs和異體OECs聯(lián)合移植入受試患者的受損脊髓中，術(shù)后的隨訪中發(fā)現(xiàn)有1例患者的神經(jīng)功能有所恢復(fù)，所有接受治療的患者沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)。

2.2.4 NSCs和施萬細胞（SCs）聯(lián)合移植

如前所述，由于施萬細胞能夠分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子及胞外基質(zhì)蛋白，改善移植細胞生長、分化的微環(huán)境，因此施萬細胞能夠提高NSCs的存活率，并促進其分化為神經(jīng)元，且能夠分泌更高水平的神經(jīng)營養(yǎng)因子[20]。Xia等[21]使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架培養(yǎng)NSCs和施萬細胞，并將其植入大鼠脊髓內(nèi)，結(jié)果提示NSCs可以存活，并且施萬細胞能夠促進其存活并向脊髓內(nèi)神經(jīng)元分化。促進髓鞘形成、有限的軸突再生及運動功能恢復(fù)。

2.2.5 OPCs和施萬細胞（SCs）聯(lián)合移植

施萬細胞能夠促進OPCs的存活、增殖、遷移以及功能修復(fù)。OPCs和施萬細胞聯(lián)合移植能夠促進脊髓損傷區(qū)域的髓鞘形成和組織修復(fù)。Xie等[22]使用過表達髓磷脂基因調(diào)節(jié)因子（MRF）的OPCs和施萬細胞聯(lián)合移植，結(jié)果表明在SCI后，OPCs和SCs聯(lián)合移植能夠通過增加髓鞘形成和促進組織修復(fù)來改善脊髓損傷大鼠模型的神經(jīng)功能。

雖然大量的細胞聯(lián)合移植實驗提示聯(lián)合移植能夠為脊髓損傷修復(fù)帶來更好的效果，但其安全性（如：在Stewart等人進行的實驗中[17]，細胞聯(lián)合移植治療后，雖然脊髓損傷大鼠的軸突密度增加、運動功能有所改善，但其中一些實驗動物在聯(lián)合移植后出現(xiàn)腫瘤，而單獨移植組并沒有出現(xiàn)腫瘤）、可行性仍然值得進一步的研究，移植物配伍策略的制定仍需要在進行更大量、更規(guī)范的基礎(chǔ)實驗、動物實驗及循證分析之后再進一步進行分析考量。

3 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在細胞移植治療脊髓損傷中的應(yīng)用

由于三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)在生物技術(shù)的應(yīng)用中具有不菲的潛力[23]，現(xiàn)在該技術(shù)正越來越受到科學(xué)界的關(guān)注。當前，三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)在各個研究領(lǐng)域中都有大量的應(yīng)用。細胞是存活于三維的微環(huán)境之中的，與傳統(tǒng)的二維（2D）細胞培養(yǎng)相比，三維細胞培養(yǎng)能夠更好地模擬體內(nèi)細胞生長的自然環(huán)境，為細胞提供良好的生理微環(huán)境。因此，三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)為研究細胞-細胞、細胞-微環(huán)境之間的相互作用提供了強力的基礎(chǔ)?？偟膩碚f，目前常用的3D培養(yǎng)支架材料大致可分為天然材料（如膠原、透明質(zhì)酸、纖維蛋白等）、合成材料（聚乳酸、聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸等）及新型復(fù)合材料（天然材料之間復(fù)合或天然材料與合成材料復(fù)合等）三大類[24,25]。在三維培養(yǎng)支架中，使用三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（如旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、攪拌式生物反應(yīng)器、灌注生物反應(yīng)系統(tǒng)等[26,27]），能夠模擬細胞生長的三維微環(huán)境。這為動物疾病模型的研究、干細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展等都奠定了堅實的基礎(chǔ)。

在干細胞移植治療脊髓損傷的研究中，三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)也被越來越多地應(yīng)用。該技術(shù)能夠為移植細胞提供更好的培養(yǎng)條件，能夠充分發(fā)揮移植細胞的優(yōu)點，為受損區(qū)域的脊髓提供更優(yōu)質(zhì)的移植細胞，從而為受損脊髓提供更加良好的修復(fù)環(huán)境?，F(xiàn)已有大量體內(nèi)、體外實驗、動物實驗表明比起傳統(tǒng)的二維（2D）培養(yǎng)，三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)對SCI后的脊髓損傷有更優(yōu)的修復(fù)作用。例如BD PuraMatrixtai肽水凝膠等三維細胞培養(yǎng)模型已經(jīng)被用于組織再生修復(fù)，可能在脊髓修復(fù)中起到重要作用[28]。Mauri等[29]研究了神經(jīng)干細胞（NSCs）在水凝膠系統(tǒng)（3D支架）中的增殖和粘附情況，能夠提高NSCs的存活能力。也有許多學(xué)者應(yīng)用三維細胞培養(yǎng)技術(shù)進行了動物實驗，如Han等人[30]在3D膠原支架中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），并將其移植入大鼠受損脊髓內(nèi)，結(jié)果與普通2D培養(yǎng)的BMSCs相比，3D BMSCs能夠顯著降低TNF-α，IL-1β，IL-6等炎性細胞因子的表達，明顯促進軸突再生及改善運動功能。Amanda等人[31]使用自組裝肽（SAPs， Selfassembling Peptides）水凝膠，使用三維培養(yǎng)技術(shù)，在無血清條件下培養(yǎng)人神經(jīng)干細胞（hNSC， human neural stem cell），使其在體外分化培養(yǎng)成為成熟、活躍的人神經(jīng)元。并在該實驗中證明了其在大鼠損傷脊髓中的功能性神經(jīng)再生潛能。大量的實驗表明3D細胞培養(yǎng)技術(shù)有潛力在脊髓損傷修復(fù)的治療上發(fā)揮重要的作用。

目前三維細胞培養(yǎng)技術(shù)在脊髓損傷修復(fù)的研究中取得了有希望的結(jié)果，也為進一步探索脊髓損傷機制、細胞移植療法治療SCI的修復(fù)機制等機制研究開創(chuàng)了新的可能。但在未來，在這項技術(shù)進入臨床試驗之前，其仍需要通過中型動物模型實驗和其他更加完善的行為學(xué)研究來得到更加確切的效果及更加安全的保障。

4 小結(jié)

由于脊髓損傷后的病理生理機制、受損脊髓修復(fù)機制非常復(fù)雜，患有脊髓損傷的患者的治療、康復(fù)一直都非常困難，是世界范圍內(nèi)的一個醫(yī)學(xué)難題。隨著對干細胞研究的深入、細胞培養(yǎng)技術(shù)和組織工程學(xué)的發(fā)展、細胞移植相關(guān)研究的開展。大量的研究證明細胞移植能夠修復(fù)脊髓損傷，結(jié)合細胞培養(yǎng)新技術(shù)以及生物高分子材料，細胞移植物的培養(yǎng)、分離純化方法也日新月異。細胞移植有很大潛力成為修復(fù)和治療脊髓損傷的一種有效治療方法。現(xiàn)雖然已進行了大量的動物實驗，一些臨床試驗也正在進行，但是細胞移植療法要真正應(yīng)用于患者身上并產(chǎn)生顯著效果，改善患者生活水平，仍然需要很長的路要走。治療的安全性、可行性也需今后大量的、更加深入的研究來進行論證。新型生物材料的開發(fā)研究，以及面對一系列生物材料的種類，其在細胞移植療法中的選擇、配伍方面，仍需要生物學(xué)家、生物化學(xué)家、骨科及神經(jīng)外科醫(yī)師之間的通力協(xié)作。