毛未賢 張萌萌 馬倩倩 高遠(yuǎn) 宋世凱 尹紀(jì)偉

1.吉林省一汽總醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130011 2.《中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志》社，北京 100102

女性絕經(jīng)后由于卵巢功能低下，導(dǎo)致骨量快速丟失，骨吸收大于骨形成，引起骨質(zhì)疏松。近年研究[1-2]表明，骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)存在相互交叉、相互作用，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松由于雌激素水平下降，可通過(guò)直接或間接作用調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞分泌免疫調(diào)控因子，影響骨吸收與骨形成。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞與淋巴細(xì)胞有共同的起源，在骨重建過(guò)程中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及免疫調(diào)控因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)骨代謝。本研究將對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組的B細(xì)胞(CD3-/CD19+)、T細(xì)胞亞群(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD3+/CD4+/CD25+)所占比例進(jìn)行研究，確定不同人群免疫細(xì)胞變化的特點(diǎn)。分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)的特征性改變及其與骨密度(bone mineral density, BMD)的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1研究對(duì)象：從吉林省一汽總醫(yī)院門診及住院患者中篩選50～70歲絕經(jīng)后女性300名，平均年齡(63.4±7.2)歲。排除患有嚴(yán)重肝、腎疾病、糖尿病、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀旁腺機(jī)能減退、甲亢、甲減、腫瘤及放化療患者；排除患有子宮肌瘤、接受過(guò)卵巢手術(shù)者及長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素治療者；排除半年內(nèi)應(yīng)用影響雌激素水平藥物者。記錄受試者一般情況，采用美國(guó)Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測(cè)BMD。按照WHO關(guān)于骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)，骨密度低于同性別峰值骨量值2.5標(biāo)準(zhǔn)差即診斷為骨質(zhì)疏松。根據(jù)BMD檢測(cè)結(jié)果，將受試者分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組[187例,(64.9±7.6)歲]和絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松組[113例，(61.4±8.5)歲]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：美國(guó)Hologic Discovery WA型骨密度儀，美國(guó)貝克曼Navios 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Thermo公司全自動(dòng)酶標(biāo)免疫分析儀；熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3-PerCP-Cyanine5.5、CD4-FITC、CD25-PE、白細(xì)胞分化抗原CD19-APC檢測(cè)試劑，均購(gòu)自安捷倫生物(杭州)有限公司；TNF-α、TGF-β1、IL-17 ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物。

1.2 方法

1.2.1檢測(cè)骨密度：采用美國(guó)Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測(cè)受試者腰椎正位(L1～4)BMD，每次開(kāi)機(jī)后均用模體校正，測(cè)量誤差小于0.5%。

1.2.2采血：抽取受試者外周靜脈血10 mL，其中5 mL用EDTA或肝素抗凝，用于B細(xì)胞、T細(xì)胞亞群分析，5 mL促凝血當(dāng)日離心分離血清，-20 ℃凍存，用于免疫調(diào)控因子檢測(cè)。

1.2.3流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞亞群：利用流式細(xì)胞儀對(duì)2日內(nèi)抽取的外周抗凝血進(jìn)行CD3+/CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD3-/CD19+ B細(xì)胞分析。

1.2.4免疫調(diào)控因子檢測(cè)：采用美國(guó)Thermo公司全自動(dòng)酶標(biāo)免疫分析儀測(cè)定血清免疫調(diào)控因子TNF-α、TGF-β1、IL-17水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組BMD檢測(cè)結(jié)果

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組BMD差異顯著，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組BMD檢測(cè)結(jié)果

2.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果分析

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組外周血T淋巴細(xì)胞(CD3+)、輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+ CD4+)百分比與絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組外周血B淋巴細(xì)胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質(zhì)疏松組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組T細(xì)胞與B細(xì)胞(CD3-/CD19+)分析

2.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群檢測(cè)結(jié)果分析

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為(6.23 ±2.76)%，非骨質(zhì)疏松組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為(8.63 ±3.19)%，與骨質(zhì)疏松組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群分析

2.4 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β1、IL-17)檢測(cè)結(jié)果比較

結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組血清TNF-α水平高于非骨質(zhì)疏松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨質(zhì)疏松組血清TGF-β1水平低于非骨質(zhì)疏松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨質(zhì)疏松組血清IL-17水平高于非骨質(zhì)疏松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNF-α與腰椎(L1～4)BMD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，TGF-β1與腰椎(L1～4)BMD呈正相關(guān)(P<0.05)、IL-17與腰椎(L1～4)BMD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4、表5。

表4 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β1、IL-17)檢測(cè)結(jié)果比較

表5 骨質(zhì)疏松組、非骨質(zhì)疏松組TNF-α、TGF-β1、IL-17與腰椎(L1～4)BMD的相關(guān)性分析

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，是表達(dá)IL-2可溶性受體α鏈(CD25)CD4+T細(xì)胞的一類細(xì)胞亞群[3]，在維持機(jī)體免疫平衡、介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受等方面具有重要的調(diào)控作用，在抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松演變進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[4-6]。CD3+/CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在骨代謝中對(duì)破骨細(xì)胞起著負(fù)調(diào)控的作用，能夠抑制破骨細(xì)胞的形成與分化，降低破骨細(xì)胞的活性。目前認(rèn)為CD3+/CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用主要通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)：一是細(xì)胞間直接接觸途徑，二是免疫調(diào)控因子依賴途徑。

免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)共享很多調(diào)節(jié)因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素17 (interleukin-17，IL-17)等，其中TNF-α、IL-17等在破骨細(xì)胞的增殖、分化、活化過(guò)程中發(fā)揮著正調(diào)控的作用[7]。TNF-α 是十分重要的破骨細(xì)胞激活因子，可直接促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的有絲分裂及破骨祖細(xì)胞的分化[8]，刺激前祖細(xì)胞產(chǎn)生新的破骨細(xì)胞；也可介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌參與破骨細(xì)胞分化所必需的“下游”細(xì)胞因子，如M-CSF、IL-6、IL-11、RANKL等，間接促進(jìn)破骨祖細(xì)胞的增殖[9]。此外，TNF-α對(duì)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能也有促進(jìn)作用，TNF-α可間接激活成熟的破骨細(xì)胞形成骨吸收陷窩，增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收功能，抑制破骨細(xì)胞凋亡[10]。IL-17是促進(jìn)骨吸收的細(xì)胞因子，IL-17能直接刺激破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化，抑制骨基質(zhì)礦化，增加成骨細(xì)胞分泌RANKL[11]，抑制骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的分泌，使RANKL /OPG 比值增大，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成[12]。TGF-β抑制破骨細(xì)胞骨吸收，調(diào)節(jié)骨吸收區(qū)新骨的形成。TGF-β參與骨與軟骨的形成，對(duì)骨組織修復(fù)具有重要的的調(diào)節(jié)作用。TGFβ通過(guò)強(qiáng)大的骨形成和骨修復(fù)作用，可增加骨密度。

B淋巴細(xì)胞一方面通過(guò)分泌TGF-β來(lái)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，另一方面是OPG的主要來(lái)源，可在T細(xì)胞刺激下，提高骨微環(huán)境中OPG水平，來(lái)抑制破骨細(xì)胞的形成[13-14]，對(duì)骨破壞具有保護(hù)作用。

T細(xì)胞及B 細(xì)胞通過(guò)影響破骨細(xì)胞分化增殖，在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。至今，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者T細(xì)胞亞群和B細(xì)胞亞群所占比例和免疫調(diào)控因子的研究甚少。本研究探討了T細(xì)胞亞群(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD3+/CD4+/CD25+)和B細(xì)胞(CD3-/CD19+)與免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)協(xié)同作用對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的影響。結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例低于非骨質(zhì)疏松組(P<0.05)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群有著明顯變化。說(shuō)明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組外周血B淋巴細(xì)胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質(zhì)疏松組女性，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)水平與非骨質(zhì)疏松女性差異明顯。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組血清TNF-α、IL-17水平高于非骨質(zhì)疏松組(P<0.05)，TNF-α、IL-17與腰椎(L1～4)BMD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；骨質(zhì)疏松組血清TGF-β1水平低于非骨質(zhì)疏松組(P<0.05)，TGF-β1與腰椎(L1～4)BMD呈正相關(guān)(P<0.05)。

Bozec等[15]研究了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在骨重建與骨相關(guān)疾病(如骨質(zhì)疏松癥或炎性骨丟失)中的作用及其調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子TGF-β、IL-10、IL-4等來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成。Treg細(xì)胞也可通過(guò)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原(CTLA-4)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制破骨細(xì)胞的分化。徐玉善等[16]分析了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的免疫系統(tǒng)變化，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞有著明顯變化，骨質(zhì)疏松組T淋巴細(xì)胞較對(duì)照組減少，B淋巴細(xì)胞升高。SC等[17]調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于雌激素分泌的減少，參與免疫反應(yīng)的T、B淋巴細(xì)胞存活延長(zhǎng)，其分泌的腫瘤壞死因子TNFα增多，直接或間接的作用于成骨和破骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞的形成和活化，導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。江艷等[18]對(duì)不同年齡組雄性SD 大鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的研究表明，Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比與骨密度呈正相關(guān)，隨Treg數(shù)量百分比增高，骨吸收減少，骨密度值升高。研究[19]表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)雌激素的反應(yīng)性更強(qiáng)，雌激素可以上調(diào)Treg 亞群比例。Pacifici R等[20]觀察到卵巢切除小鼠的T細(xì)胞缺陷能夠拮抗骨量的流失；而Lee等[21]發(fā)現(xiàn)卵巢切除小鼠的T細(xì)胞缺陷并不能阻止皮質(zhì)骨的骨量流失，提示T 細(xì)胞在骨重建過(guò)程中的作用錯(cuò)綜復(fù)雜。

Onal等[22]的研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在正常骨重建過(guò)程中發(fā)揮的作用很少，但在雌激素水平下降時(shí)，可抑制破骨細(xì)胞的分化。Breuil等[23]觀察絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者B 淋巴細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組減少，并與骨密度負(fù)相關(guān)。Li等[24]發(fā)現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞在卵巢切除后活化，其表達(dá)的共刺激分子配體CD40 L 與B 淋巴細(xì)胞表面CD40 結(jié)合，從而促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞對(duì)OPG 的產(chǎn)生。如果T 淋巴細(xì)胞缺陷，或無(wú)CD40 和CD40 L 的表達(dá)，小鼠將表現(xiàn)OPG 減少，誘發(fā)骨質(zhì)疏松，表明T、B 淋巴細(xì)胞可相互作用、相互影響，從而在骨代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

IL-17主要由輔助T細(xì)胞17(Th17)分泌。IL-17 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體、基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的RANKL 表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化與生成[25]。CJ等[26]研究發(fā)現(xiàn)IL-17 參與了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，抑制IL-17或其受體能減少骨量的丟失。Tyagi等[27]的研究證明，雌激素缺乏誘導(dǎo)IL-17生成，刺激破骨細(xì)胞的分化，在預(yù)先使用雌激素(E2) 處理后被逆轉(zhuǎn)，認(rèn)為雌激素缺乏誘導(dǎo)IL-17生成是骨質(zhì)疏松的一個(gè)新的候選發(fā)病機(jī)制。Talaat等[28]的研究說(shuō)明Th17 細(xì)胞和其細(xì)胞因子鏈 IL-6、IL-17、IL-23 升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg 細(xì)胞)和其細(xì)胞因子鏈IL-10、TGF-β降低，對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。

當(dāng)雌激素缺乏時(shí)，TNF-α促進(jìn)OC 前體細(xì)胞的增殖分化和成熟OC 的活性，抑制OB 的形成和成熟OB 的功能，增強(qiáng)骨吸收，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究[29]表明，TNF-α在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中顯著上調(diào)，TNF-α可通過(guò)激活NF-κB促進(jìn)RNAKL誘導(dǎo)的體外破骨細(xì)胞形成。有學(xué)者[30]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者和絕經(jīng)后骨量減少者血清TNF-α和IL-6水平均明顯高于正常者，差異有顯著性。提示TNF-α和IL-6可作用于破骨細(xì)胞，刺激骨吸收作用。Zhu S等[31]對(duì)TNF-α基因敲除小鼠預(yù)防骨質(zhì)流失與骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用研究顯示，TNF-α基因的敲除可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞相關(guān)基因(Runx2和Col1a1)的mRNA表達(dá)，并下調(diào)破骨細(xì)胞相關(guān)mRNA抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和組織蛋白酶K(CTSK)的表達(dá)。

TGF-β促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，Selvamurugan等[32]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，刺激骨形成的重要途徑。鄧盎等[33]研究雌激素受體β基因沉默對(duì)人成骨細(xì)胞TGFβ1表達(dá)的影響，結(jié)果提示雌激素受體β可能通過(guò)調(diào)控TGFβ1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 的表達(dá)在骨代謝中發(fā)揮作用。Tian等[34]的研究指出TGF-β對(duì)于骨重建和骨骼修復(fù)是最重要的。TGF-β能刺激前成骨細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)骨重建。

本研究對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與非骨質(zhì)疏松人群的B細(xì)胞(CD3-/CD19+)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD3+/CD4+/CD25+)亞群的分析顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群有著明顯變化，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞亞群占CD4+T淋巴細(xì)胞的比例低于非骨質(zhì)疏松女性，外周血B淋巴細(xì)胞(CD3-/CD19+)百分比低于非骨質(zhì)疏松組女性，血清免疫調(diào)控因子(TNF-α、TGF-β、IL-17)水平與非骨質(zhì)疏松女性相比，差異顯著。T淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞與免疫調(diào)控因子協(xié)同作用，通過(guò)影響破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化、增殖，調(diào)節(jié)骨重建，骨質(zhì)疏松與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切關(guān)聯(lián)。