天津市海河醫(yī)院（300350）秦中華

流感具有較高發(fā)病率及死亡率，在各個(gè)國家均有不同程度的發(fā)生率，導(dǎo)致急性呼吸道感染的主要病原之一，其屬于正黏病毒科，是有包膜以及分階段的單股負(fù)鏈RNA病毒[1]。目前流行病毒主要分為甲型及乙型，甲型流感病毒抗原變異較為活躍，對世界范圍具有一定影響；乙型流感病毒感染及傳播能力較甲型弱，但也會引起一定程度暴發(fā)流行。我國是流感病毒高發(fā)區(qū)，近年來，流感發(fā)生率不斷升高，直接威脅人類生命健康[2][3]。因此，臨床需尋求快速、準(zhǔn)確且適用于臨床應(yīng)用的流感病毒診斷方式，以早期診斷、隔離及治療。研究顯示，流感病毒檢驗(yàn)方式較多，但目前臨床對其研究并不多見，為此，本文旨在對國內(nèi)外流感病毒檢驗(yàn)相關(guān)方法進(jìn)行綜述，為臨床診斷提供思路?，F(xiàn)綜述如下。

1 病毒分離鑒定

病毒分離法是一種檢測流感病毒的傳統(tǒng)方式，雖然具有敏感性高且精確度高等優(yōu)點(diǎn)，且可在一定程度上檢測出病毒毒株情況，但是也具有一定局限，如檢測周期較長，具有一定安全隱患，故不適宜大規(guī)模應(yīng)用[4]。研究學(xué)者表明，在細(xì)菌培養(yǎng)后常常通過免疫熒光技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，排除其他病毒可能性后，檢測甲型流感病毒核蛋白，做出診斷。王林等[5]研究選取流感高峰季節(jié)收集流感哨點(diǎn)醫(yī)院流感病例標(biāo)本（ILI）1025份，采用犬腎傳代細(xì)菌培養(yǎng)及實(shí)時(shí)熒光定量檢測，對比兩種方式檢驗(yàn)差異情況；研究結(jié)果顯示，在選取病例中，實(shí)時(shí)熒光定量檢測流感病毒核酸陽性率為26.63%，細(xì)胞培養(yǎng)檢出12.58%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在273份陽性標(biāo)本中，分離出118株病毒株，占43.22%，752例陰性標(biāo)本中，分離出11株病毒株，占1.46%，實(shí)時(shí)熒光定量法檢驗(yàn)陽性標(biāo)本及陰性標(biāo)本分離率差異顯著。根據(jù)其研究可發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量檢測速度較快，靈敏性高，適用于臨床檢測及診斷流感疫情；細(xì)胞培養(yǎng)能夠獲得毒株，可進(jìn)行基因特異性及耐藥性等深入研究，二者結(jié)合診斷效果更佳。

2 免疫學(xué)檢測

2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 免疫學(xué)檢測也是檢測流感病毒常用方式之一，其主要依據(jù)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)，一般需要對血清中的抗原或者抗體進(jìn)行檢測。其中酶聯(lián)免疫吸附法可用于檢測抗原或抗體，具有方便快捷、靈敏度及特異度高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前臨床較為常用的免疫測定方式之一[6]。章倩云等[7]針對禽流感病毒M基因、H7基因以及N9基因的基因片段保守序列，進(jìn)行特異性標(biāo)記后，通過酶聯(lián)免疫吸附法對PCR擴(kuò)增情況進(jìn)行判斷；研究結(jié)果顯示，其檢測三個(gè)基因片段最低拷貝數(shù)敏感性高于普通PCR技術(shù)的10～100倍；此外，在不同流感病毒亞型間，不同病毒之間均不存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象；通過對臨床114份標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與雞胚培養(yǎng)符合率達(dá)到100%。根據(jù)其研究結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附法操作簡單，具有較高靈敏度及特異度，可廣泛應(yīng)用于流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測。

2.2 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)具有檢測結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是其仍具有一定局限，如對制備抗原具有較高要求，可能會產(chǎn)生非特異性染色體[8]。何潔靜等[9]研究運(yùn)用雙抗夾心建立柯薩奇病毒A16型的時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)，對該種方法檢測的靈敏度及特異度等進(jìn)行分析；研究結(jié)果顯示，時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)的檢驗(yàn)，靈敏度為0.02ng/ml，回收率為100.2%～101.5%之間，將其與金標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)相比，檢測結(jié)果的相關(guān)性較酶聯(lián)免疫吸附法高。根據(jù)其研究結(jié)果可知，時(shí)間分辨免疫熒光法具有操作簡單、靈敏度及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床篩查柯薩奇病毒A16型。

2.3 膠體金免疫標(biāo)記法 既往相關(guān)研究報(bào)道，通過膠體金可有效檢測人絨毛膜的促性腺激素，這也成為臨床免疫學(xué)研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)，受到臨床醫(yī)學(xué)界及研究界廣泛關(guān)注[10]。多年前，相關(guān)研究學(xué)者開始申請有關(guān)膠體金快速檢測試紙相關(guān)專利，近年來，不少研究學(xué)者采用膠體金免疫法檢測流感病毒，并取得一定研究結(jié)論。如鄭嘉庚等[11]學(xué)者為建立一種快速定性檢測血清丙型肝炎病毒（HCV）抗體方式，其根據(jù)雙抗原夾心法實(shí)驗(yàn)原理，建立膠體金免疫層分析法對人體血清中丙型肝炎抗體進(jìn)行檢測；研究結(jié)果顯示，陰性參考品及陽性參考品符合率達(dá)到100%，平行測定10條重復(fù)性參考品，全部顯示陽性；通過檢測血清1050份標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，其與酶聯(lián)免疫吸附法符合率高達(dá)96.9%；又經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，該方法檢測靈敏度（97.90%）、特異度（99.00%）均較高。根據(jù)其研究可見，膠體金免疫標(biāo)記法是一種更加方便、快速檢測血清中HCV抗體方式，可為臨床診治提供重要參考價(jià)值。

3 流感病毒的核酸檢測

3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一項(xiàng)可在較短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，具有敏感性、特異性高等特點(diǎn)，可在較短時(shí)間內(nèi)對流感病毒進(jìn)行檢測，對早期診斷流感病毒感染具有較高價(jià)值[12]。研究顯示，PCR技術(shù)用于病原體的確定，可有效檢測出早期感染患者，與病毒分離法比，其敏感性強(qiáng)500倍，但一般的PCR技術(shù)具有一定污染。蔡航航等[13]為了對比免疫組化法與PCR技術(shù)對EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP-1）的檢測價(jià)值，其選取50例鼻咽癌患者以及50例鼻咽炎患者進(jìn)行分析對比，分別對不同患者標(biāo)本采用免疫組化法及PCR技術(shù)進(jìn)行檢測；研究結(jié)果顯示，與免疫組化法比，PCR技術(shù)檢測LKP-1的靈敏度、準(zhǔn)確度均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩種方式診斷特異度無差異。根據(jù)該研究結(jié)果可知，PCR用于檢測LMP-1具有較高診斷準(zhǔn)確度及靈敏度，用于臨床具有更高價(jià)值。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)（LAMP） LAMP是一種DNA環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增方法，目前被臨床廣泛應(yīng)用于檢測多種病毒。目前的基因特異性擴(kuò)增可通過光度法檢測反應(yīng)結(jié)束時(shí)溶液中所釋放的相關(guān)副產(chǎn)物。研究顯示，LAMP靈敏度與PCR相似，已被臨床廣泛應(yīng)用于檢測流感病毒。如趙娜等[14]應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測乙型肝炎病毒，通過檢測乙型肝炎病毒毒株以及臨床樣本，評價(jià)LAMP的靈敏度、特異度以及抗干擾性，并將研究結(jié)果與PCR進(jìn)行對比；研究顯示，LAMP技術(shù)特異性高，未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；煮沸法的LAMP與PCR技術(shù)具有較好一致性。根據(jù)該研究學(xué)者結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)在檢測乙型肝炎病毒中具有一定優(yōu)點(diǎn)，通過該方式檢測有利于提高臨床檢出率，為早期診治提供重要參考價(jià)值。此外，基因芯片法也是核酸檢測方式之一，可對數(shù)萬個(gè)基因進(jìn)行檢測，該種方式通過在支持物上固定大量探針分子，將其與標(biāo)記的樣本分子進(jìn)行雜交，進(jìn)而通過所獲得信號強(qiáng)度，對樣本相關(guān)數(shù)量及序列相關(guān)信息進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，該種方式具有較高靈敏度及特異度，但其對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，價(jià)格昂貴，不方便一般檢測。

4 小結(jié)與展望

流感是分布于全球的感染性疾病，不僅對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅，也給國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展及社會穩(wěn)定造成一定威脅，故尋求安全可靠的流感病毒檢測方式成為臨床研究重點(diǎn)。病毒分離鑒定是檢測流感病毒傳統(tǒng)方式，其可有效檢測出病毒毒株，具有精確度高等優(yōu)點(diǎn)，但是其具有一定局限性，如操作較為復(fù)雜，等待時(shí)間長，很難被臨床推廣。核酸檢測法是一種有效檢測流感病毒方法，與傳統(tǒng)方式比，其可在短時(shí)間內(nèi)完成檢測，但是其也具有一定局限性，如對檢測技術(shù)人員要求較高，且價(jià)格昂貴，應(yīng)用不多。免疫學(xué)檢測操作簡單，對檢驗(yàn)人員要求不高，特別是膠體金免疫標(biāo)記法所需時(shí)間更短，可現(xiàn)場檢測，較為方便；其中酶聯(lián)免疫吸附法具有檢驗(yàn)迅速、靈敏度高且可定量等優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用。因此，臨床需結(jié)合不同地區(qū)對流感病毒檢測要求，選擇適宜的檢測方法及設(shè)備，提高診斷準(zhǔn)確率。