甘鳳山，趙嫻

( 昆明醫(yī)科大學附屬附屬第一醫(yī)院整形外科，云南 昆明)

0 引言

充質干細胞(MSC)是一種來源于骨髓的非造血細胞。40年前Friedenstein[1]等人首先提出間充質干細胞的概念。2006年，國際細胞治療協會定義人間充質干細胞的最低標準。它們必須有粘附特性，且能分化成骨細胞，軟骨細胞以及脂肪細胞。同時，它們必須能夠表達CD105，CD90 和CD7，但對于CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19 以及HLA-DR 表面分子的表達卻是缺失的[2]。人們在臨床多個領域嘗試應用這些細胞，比如神經內科、心血管內科及骨科，用于修復大塊骨缺損。MSC 的歸巢屬特性和在靶器官的持久性，使其擁有以上諸多用途。目前，造血干細胞移植多通過靜脈注射完成。為治療需要而全身輸注細胞意味著需要有高效的遷移和歸巢到靶部位的能力。在本篇綜述中，我們討論了關于MSC 歸巢的現有知識，特別是著重于骨髓歸巢，總結了目前提高MSC歸巢效率的方法。

1 MSC 歸歸巢和遷移到骨髓和其他組織

MSC 遷移和歸巢到組織的確切機制尚未完全闡明。一般認為，這些干細胞遵循與白細胞歸巢相同的步驟。第一步，這些細胞通過粘附和滾動與內皮細胞接觸，導致血液流動速度減慢；第二步，細胞被G 蛋白偶聯受體激活，緊接著被整合素介導的激活依賴性阻滯激活；最后，細胞通過內皮細胞和底層基底膜進行遷移。

在動物模型和患者身上已經證明，MSC 具有遷移并歸巢到各種組織的能力。早期在動物模型中進行的子宮內膜間充質干細胞移植研究表明，供體來源的非造血細胞存在于骨髓、胸腺、脾臟和肝臟中。Devine 等人的[3]和Chapel 等人的[4]在非人類靈長類動物中進行了MSC 移植，并在多種組織中觀察到MSC，在胃腸道中數量最多。MSCs 在不同組織中的百分比為估計介于0.1%和2.7%之間。Erices 等人的[5]描述了人臍帶血來源的MSCs 經全身輸注后在免疫缺陷(裸)小鼠骨髓中的歸巢和存活。幾項對患者的研究中也顯示MSC 具有歸巢能力。

有研究小組使用不同的技術手段分析了系統(tǒng)灌注骨髓間充質干細胞后的遷移動力學。輸注后，MSCs 立即聚集在肺內，隨后，細胞被從肺中清除并分布到其他組織。這些細胞可通過靜脈或動脈內注射進行全身灌注。前者是侵入性最小、操作最簡便的方法;然而，相對于靜脈，動脈注射因為需要動脈穿刺風險較高，也可能導致微血管閉塞癥的發(fā)生。

Kyriakou 等人研究了影響MSCs 短期骨髓歸巢的因素。靜脈注射后24 小時，分別在骨髓、脾臟、肝臟和骨髓中觀察到干細胞。并且注意到，放射線對幼齡動物的歸巢作用明顯增強并隨細胞的傳代次數的增加而減少[6]。

2 MSC 歸巢到骨髓的相關分子

在歸巢的過程中不同的分子參與不同的步驟。內皮細胞上的選擇素主要參與第一步。特別是對于骨髓歸巢，造血細胞E-/ l -選擇素配體(HCELL)的表達是非常重要的，HCELL是CD44 在遷移細胞上的一種特殊的糖型。雖然MSCs 表達CD44，但它們不表達HCELL。

參與活化步驟的G 蛋白偶聯受體通常是趨化因子受體。已經廣泛證明CXCR4-基質衍生因子-1 (SDF-1)軸對骨髓歸巢[7]至關重要。

整合素在第三步的穩(wěn)定激活依賴性阻滯中起重要作用。有研究表明，抑制整合素β1 可以抑制MSC 歸巢。整合素形成二聚體，與內皮細胞上的粘附分子結合。整合素α4 和β1相結合，形成遲發(fā)性抗原4 (VLA-4)并與血管細胞粘附分子1 (VCAM-1)相互作用。已有研究表明，VCAM-1-VLA4 相互作用在MSC 歸巢中起作用。

基質金屬蛋白酶(MMP)等溶解酶裂解基底膜的組分是通過內皮細胞層和基底膜進行轉運的最后一步。特別是，明膠酶MMP-2 和MMP-9 在這一步中起重要作用，因為它們優(yōu)先降解膠原和明膠，這是基底膜的兩個主要成分。我們發(fā)現MSC 的遷移受MMP-2 和組織抑制金屬蛋白酶3 (TIMP-3)的調控。MT1-MMP 在MSC 遷移中起作用?；|金屬蛋白酶是作為前酶分泌的。ProMMP-2 通過與MT1-MMP 和TIMP-2的相互作用被激活，并被TIMP-1 抑制。這解釋了為什么MMP-2、MT1-MMP 或TIMP-2 敲除降低了MSCs 的侵襲能力，以及Ries 等人發(fā)現的TIMP-1 敲除導致了的侵襲增加[8]。

除了經典的歸巢表達外，不同的研究小組也描述了MSCs上生長因子受體的表達。多項研究表明，生長因子也可誘導間充質干細胞遷移。例如，血小板衍生生長因子(PDGF) AB和BB 可在體外誘導間充質干細胞遷移[9]。另一個參與間充質干細胞遷移的生長因子是肝細胞生長因子(HGF)，它與c-met 結合。PDGF-BB 和HGF 均已作為一種改善MSCs 體外遷移的手段復合于凝膠或支架上[10,11]。

3 如何增加MSC 的歸巢效率

MSC 歸巢效率與幾個因素被認為是有關的。首先，MSCs上的歸巢分子表達有限。另一個值得關注的問題是，MSCs 在體外擴增過程中似乎失去了歸巢分子的表達。此外，間充質干細胞培養(yǎng)和來自不同組織的間充質干細胞中也存在歸巢分子的異質表達，其歸巢分子表達譜不同[12]。

由于提高MSCs 在全身給藥后的歸巢效率和在靶組織中的保留將提高它們的治療效果，許多研究小組正在研究實現這一目標的方法。主要通過一下策略來實現。

3.1 聯合藥物輸注

體內研究反復表明，經靜脈注射后，間充質干細胞被困在肺內。在給小鼠輸注骨髓間充質干細胞之前，給小鼠輸注血管擴張劑，可以明顯減少在肺部截留的間充質干細胞的數量，并顯著增加間充質干細胞向長骨骨髓的回流。湯川等[13]將MSCs 移植聯合肝素治療這一策略也顯著減少了MSC 在肺部的滯留。

3.2 骨髓間充質干細胞培養(yǎng)前的處理，或改變培養(yǎng)條件

增加膜上CXCR4 的表達是目前研究的重點。實現這一目的的一種方法是在擴增過程中向培養(yǎng)基中添加細胞因子或細胞因子混合物。有研究表明，flt3 配體、干細胞因子(SCF)、IL 3、IL 6 和肝細胞生長因子(HGF)聯合作用可增加培養(yǎng)的msc 上細胞內和膜上CXCR4 的表達。預處理后的細胞更多地向SDF-1 梯度遷移，預處理對MSCs 支持造血的功能沒有影響。在體內歸巢實驗中，MSCs 被靜脈注射到亞致死照射的小鼠體內，發(fā)現細胞因子治療后骨髓歸巢顯著增加。其他分子，已經被證明可以增加趨化因子受體CXCR4 表達，比如胰島素樣生長因子1 (IGF - 1)、腫瘤壞死因子α(TNFα)，IL 1β，干擾素γ(IFNγ)[14]。BMS 培養(yǎng)時經糖原合成酶激酶3β(GSK - 3β)抑制劑處理后，可以上調趨化因子受體CXCR4 表達，使其體外遷移能力增強，而不影響細胞的生存能力[15]。經證實，BMS 暴露于補體1q (C1q)，雖然CXCR4 表達沒有顯著增加，但可增加MSC 向SDF-1 的遷移。

經GSK-3β 抑制劑和C1q 處理后，增加BMS 的MMP 表達，而MMP 在遷移過程中對基底膜的降解至關重要。造血生長因子促紅細胞生成素(EPO)和粒細胞的結合集落刺激因子(G-CSF)也被報道可增加MMP-2 在MSCs 中的表達并改善其運動能力[16]。

也有證據表明，短期暴露于丙戊酸誘導的表觀遺傳調制導致培養(yǎng)的BMS 中CXCR4 和MMP-2 的表達增加，并向SDF-1 的遷移增加。并且對細胞的分化能力沒有影響[17]。

另一種正在研究的方法是在缺氧條件下培養(yǎng)MSCs。幾組研究表明，這些條件導致CXCR4 表達增加，并改善了MSC在體內和體外的遷移。據報道，趨化因子受體CXCR4 表達的增加是因為缺氧誘導因子(HIF) 1α 增加。缺氧還導致MMPs的差異表達。比如，在缺氧條件下培養(yǎng)的MSCs 中，MMP-2的分泌減少，MT1-MMP 的分泌和活性增加。

對培養(yǎng)條件的一種較簡單的改變是保持較低細胞融合度。有的課題組發(fā)現培養(yǎng)至完全融合的骨髓間充質干細胞的遷移能力低于維持在低融合狀態(tài)的骨髓間充質干細胞。與低融合培養(yǎng)的MSCs 相比，高融合培養(yǎng)的細胞分泌更多的MMPs抑制劑TIMP-3，限制了MSCs 的遷移。

3.3 基因改造

由于CXCR4-SDF1 軸對骨髓歸巢很重要[18]，許多研究小組設計了轉染或轉導的實驗，在實驗中，CXCR4 表達質粒或以非病毒方式或病毒方式進入細胞。在NOD/SCID 移植模型心內注射后，CXCR4 過表達可改善MSC 向骨髓的歸巢。在類似的模型中，整聯蛋白α4(VLA4 的一個亞基)的過表達與VCAM-1 相互作用，也促進了BMS 向骨髓歸巢。然而，這種技術也有一些缺點。最重要的是，人們擔心使用病毒載體引入質粒DNA 會帶來插入性腫瘤形成的風險。

不同的質粒DNA 非病毒轉染模式已經被開發(fā)出來。有究小組使用mRNA 核轉染的方法使MSC 中的CXCR4 過表達。他們獲得了表面受體90%的表達，但細胞存活率僅為62%，未觀察到間充質干細胞歸巢的增加[19]。另一組研究了利用超聲和微泡在msc 中插入短干擾RNA 以提高存活率的可行性。可以獲得顯著的靶基因敲除(PTEN)，但操作后細胞受到損傷。

3.4 細胞表面工程

近年來引起人們興趣的一種提高MSCs 歸巢效率的方法是細胞表面工程，即細胞表面的時的修飾。已有研究表明，這些修飾不影響細胞的活力、增殖、粘附或分化[20-22]。

2008 年，Sackstein 等人發(fā)表了一篇關于這一領域的開創(chuàng)性論文，他們報告說，他們已經將在MSC 上表達的天然CD44在體內轉化為造血細胞E-選擇素/ L-選擇素配體(HCELL)的糖苷形式。E -選擇素在造血干細胞(HSC)向骨髓定向過程中起關鍵作用，然而，MSC 不表達HSC 骨髓歸巢所需的兩種E -選擇素配體P -選擇素糖蛋白配體-1 (PSGL-1)或HCELL，從而削弱了它們對骨髓的歸巢能力[23]。MSC 本身表達CD44。Sackstein 等人能夠將CD44 轉化為HCELL 糖體。這種處理對細胞的活力和表型沒有影響。在NOD/SCID小鼠尾靜脈注射間充質干細胞的體內歸巢實驗表明，即使在CXCR4 缺失的情況下，HCELL+間充質干細胞仍歸巢至骨髓。

Sialyl Lewis X (SLE X)是PSGL-1 的活性位點。因此，將這種分子引入間充質干細胞膜中也可以改善間充質干細胞的歸巢。Sarkar 等[24]使用生物素化微囊泡修飾MSCs。當囊泡與間充質干細胞接觸時，它們融合到細胞膜中，從而產生生物素化的間充質干細胞。利用鏈霉親和素連接劑，生物素化的SLE X 可以固定在細胞表面。體外實驗表明，對照組的MSCs相比，表達SLE X 的MSCs 在剪切應力作用下表現出更好的黏附性。

Lo 等人[25]描述了另一種工程方法來改善MSC 與選擇素的結合并促進吸附和轉移。將PSGL-1 (Fc19)的前19 個氨基酸與IgG 尾巴和SLEX 糖鏈結合，形成泛選擇結合配體。這些MSC 在剪切應力作用下確實具有粘附能力。

3.5 目標組織的修飾

最后，MSC 的遷移和歸巢可以通過修飾靶組織來影響。在早期的歸巢研究中，已經證明了通過輻射改變目標組織來增加MSC 歸巢?；熀头暖熀?，骨髓中SDF-1 水平升高，對造血干細胞和間充質干細胞的吸引力增強。

4 結論

間充質干細胞可用于多種治療，具有不可替代的優(yōu)勢。問題在于其歸巢效率低，達不到理想的治療效果?，F有研究表明間充質干細胞幾乎不表達或很少表達歸巢相關受體，因此限制了其遷移能力，從而減少了其歸巢效率及治療效果。而造成這種分子的低水平表達的原因和MSCs 在培養(yǎng)、擴增過程中培養(yǎng)方式和方法的不同導致了這種歸巢相關因子的丟失有關。本文總結了改進MSC 歸巢的策略和方法。這些方法都表現出有利于MSC 歸巢到目標組織，但是其中有許多尚未在體內得到驗證。在將這些技術應用于臨床之前，應該首先在體內歸巢模型中對這些技術進行驗證。目前MSC 的分離和擴增方法存在很大的差異。分離和擴增方法的不同可能對MSC 功能、遷移和歸巢產生重大影響，未來應建立標準化的MSC 分離和擴增方法，這也將更容易評估MSCs 在臨床環(huán)境中的治療效果。另外，間充質干細胞歸巢的機制尚未完全闡明，仍有大量研究針對其進行。更好的理解間充質干細胞歸巢機制以及影響這一過程的因素，將使研究人員能夠優(yōu)化這些干細胞的遷移能力及其在靶組織中的治療效果，也將有利于其更好的應用于臨床，對間充質干細胞發(fā)揮更大的治療作用具有重要意義。