高 潔 李 靜 王 剛 文 婷 盧曉宇*

(1.陜西博薈精準醫(yī)療科技有限責任公司，西安710000；2.陜西友誼醫(yī)學檢驗實驗室，西安710000)

1 引言

維生素為結構上互不相關的一組化學物質，人體內可分為脂溶性維生素和水溶性維生素。維生素D是體內重要的營養(yǎng)素，維生素D本身不具備生理功能，只有轉變?yōu)榛钚孕问讲拍馨l(fā)揮生理活性。維生素D的主要活性形式有：25(OH)D2/D3、1,25-(OH)2D2/D3、24,25-(OH)2D2/D3等。維生素D攝入后首先經過肝臟活化成25(OH)D2/D3進入循環(huán)系統(tǒng)，部分單羥基VD進入腎臟活化為活性更強但半衰期更短的1,25-(OH)2D2/D3。由于雙羥基VD在血液中穩(wěn)定性差且含量極少，一般不推薦作為臨床檢驗的檢測指標。維生素D各種活性形式在人體肌肉與骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等發(fā)揮著類激素效應，最近的研究顯示, 維生素D缺乏還與腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等慢性疾病相關[1, 2]。

維生素D的過量或缺乏都會導致健康問題的發(fā)生：缺乏可能會導致兒童佝僂病，成人骨軟化，增加繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、骨密度降低、骨折、糖尿病、心血管疾病、自身免疫學疾病、腎臟疾病等發(fā)病風險；孕婦增加妊娠糖尿病、先兆子癇、細菌性陰道炎、產后及絕經后婦女骨質疏松風險，影響新生兒智力發(fā)育。過量可能會導致高鈣血癥、肌無力頭痛、厭食、嘔吐、骨痛、異位性鈣化、蛋白尿、高血壓和心律失常；兒童過量補充導致小兒骨髓過早形成，生長停滯。其中，兒童、孕產婦及老年人是維生素D缺乏的高危人群。有研究表明，孕產婦維生素D缺乏率可高達75%以上[3]。

目前，檢測維生素D的方法有免疫法、放射免疫法、液相色譜法以及液相色譜-串聯質譜聯用法等。美國內分泌學會推薦采用25(OH)D水平評價患者體內的維生素D狀況，不推薦使用血清1,25-(OH)2D2/D3檢測評價維生素D缺乏，僅在監(jiān)測特定情況如獲得性和遺傳性維生素D和磷酸鹽代謝紊亂時應用。隨著LC-MS/MS分析靈敏度的提高，已經可以同時測量25(OH)D2和25(OH)D3，由于檢測更加準確、穩(wěn)定，被認為是檢測維生素D的金標準[4]。

目前，多篇文章報道了有關血液樣本測量25(OH)D2和25(OH)D3的檢測方法，脂溶性維生素A、E、K、D聯檢的方法也有報道。但是，這些檢測方法前處理比較繁瑣，血液樣本在運輸途中十分不便，樣本用量大，信號靈敏度不夠。本文方法通過專用的干血點(DBS)樣本，通過分析物衍生過程，增強了分析物在電噴霧正離子源(ESI+)中的離子化效率，提高檢測的靈敏度，從而降低了樣本用量和試劑使用量。只要需要一個8mm孔徑大小的全血DBS樣本；使用0.3%甲酸甲醇溶液進行超聲提取分析物。簡化了樣本前處理過程，提高檢測的靈敏度。分析物通過超高效液相-串聯質譜平臺檢測降低了系統(tǒng)誤差，使用同位素內標消除基質效應，同時增加了被檢測物質信號信噪比，從而更準確穩(wěn)定測量DBS中25(OH)D2和25(OH)D3含量。

DBS采樣法方便快捷，只需要將全血滴在專用的干血片濾紙上。與常規(guī)采樣相比有不受時間、地點、儲存及運輸方便的優(yōu)勢。同時樣本的儲存過程的穩(wěn)定性大大提高。這樣DBS樣本在疾病篩查中的優(yōu)勢逐漸凸顯出來。

本研究基于LC-MS/MS 與自動化液體處理平臺聯用, 建立了一種樣本消耗量低、準確、靈敏、快速檢測DBS 樣本中25(OH)D2和25(OH)D3的方法。

2 實驗及方法

2.1 儀器、試劑與材料

日本島津8050CL液相色譜-串聯質譜聯用儀，島津C18柱(50 mm×2.1 mm, 日本島津公司); Whatman 903 CF12 濾紙(美國GE 公司); 96 通道氮吹儀(上海巴玖實業(yè)有限公司); 96孔樣品板(單孔容積450 微升)、標準品25(OH)D2(純度95%，江蘇豪思生物)、標準品25(OH)D3(純度98%，江蘇豪思生物); 穩(wěn)定同位素內標25(OH)D2-D6(純度≥95%, 江蘇豪思生物); 穩(wěn)定同位素內標25(OH)D3-D3(純度≥98%, 江蘇豪思生物); 4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD, 純度≥98%, 美國Sigma-Aldrich 公司); 甲酸銨(純度≥98%, 美國Fisher公司); 甲酸(FA)、乙睛、甲醇(HPLC級, 美國Fisher公司); 無水乙醇(HPLC級，美國Fisher公司)、乙酸乙酯(HPLC級，美國Fisher公司); 10×PBS 緩沖液(pH 7.4, 美國Thermo Fisher 公司);全血樣本采自友誼檢驗所各業(yè)務醫(yī)院。

工作試劑的配制：分別將標準品25(OH)D2和25(OH)D3按照江蘇豪思生物試劑盒配比濃度配置，試劑盒穩(wěn)定同位素內標25(OH)D2-D6 和25(OH)D3-D3-80℃保存?zhèn)溆?使用時根據需要取配制成所需濃度的工作液。準確稱取適量的PTAD, 溶于乙酸乙酯中, 制成0.2 mg/mL 的PTAD溶液。

2.2 DBS樣本采集

樣本來自于陜西省友誼實驗室各業(yè)務醫(yī)院。醫(yī)院采樣標準：1歲以內嬰兒采用足跟采血、1歲以上兒童采用指尖采血。用一次性采血針(推薦規(guī)格：21G23G)刺中指或無名指指尖或者新生兒足跟的兩側，深度小于2毫米，擦去第一滴血，從采集點的下方捏住穿刺位點，輕柔、間歇性地對周圍組織施加壓力，增加血流量；將濾紙片血圈中心接觸血滴，切勿觸及皮膚，使血液自然滲透至濾紙背面，避免重復滴血，至少采集2個血斑；手持消毒干棉球輕壓采血部止血；將血片懸空平置，自然晾干呈深褐色。避免陽光或紫外線照射、烘烤、受潮以及揮發(fā)性化學物質污染；及時將檢驗合格的濾紙干血片置于密封袋內，密閉保存在28攝氏度冰箱中。

合格末梢血血片標準：單片血斑直徑為8mm(50微升以上)；血斑自然滲透，濾紙正反面一致；血斑無污染；血斑無滲出血環(huán)；采集信息完整、字跡清晰可見。

2.3 DBS 樣本前處理

用8mm的打孔器在DBS樣本上打孔1個備用；制備標準物質載體，使用干凈的干濾紙片依次用8mm的打孔器打出9個空白紙片；使用北京豪斯生產的試劑盒分別配置標準曲線S1～S7備用；精密量取30μL 的S1～S7標準品和質控品分別滴于9個空白濾紙片上標記;精密量取15μL的內標溶液滴于DBS樣本上，徹底晾干。

分別將干燥標準品、質控品、DBS樣本的濾紙片置于1.5m的離心管中；密移取200μL的0.3%甲酸的甲醇溶液，超聲30分鐘；將超聲后的離心管置于1000rmp離心機中5分鐘，吸取180μL上清液，于96MTP板中，氮氣吹干；向微孔板樣本中加入50μL的PTAD溶液，于500rmp、20℃震蕩混勻器，混勻1小時；向的微孔板中加入160μL的無水乙醇溶液，靜置10min，氮氣吹干。精密移取50μL 50%甲醇水(1∶1/V∶V)溶液，分別加入至氮氣吹干的樣本96MTP板中，1000rpm渦旋振蕩10分鐘，震蕩均勻;復溶樣本于4 ℃、4000 rpm離心20 分鐘，準備上機;將含樣本的96孔板置于LC-MS/MS中進行檢測。

2.4 色譜-串聯質譜分析

液相色譜條件：色譜柱：Shim-pack Velox C18 色譜柱(2.1mmI.D.x50mm L, 2.7μm)；流動相：流動相A(0.1%甲酸-2mM乙酸銨水溶液)；流動相B(0.1%甲酸甲醇溶)；流速：0.5mL/min；色譜柱溫：40攝氏度; 進樣量：10μL；自動進樣器溫度：4攝氏度；洗脫方式：梯度洗脫，B相初始濃度為80%，時間程序設定見表1。

表1 色譜時間程序

質譜條件：離子源：ESI(+)；霧化氣流速：3.0L/min；加熱氣流速：10.0L/min；干燥氣流速：10.0L/min；DL溫度：160℃；加熱模塊溫度：500℃；接口溫度：350 ℃；駐留時間：19.0 ～41.0 ms；最大循環(huán)時間：0.44s；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)，MS掃描參數見表2。

表2 MS掃描參數

3 結果與討論

3.1 高效液相色譜-串聯質譜的條件優(yōu)化

離子對衍生化優(yōu)化：由于25(OH)D電噴霧電離條件下很難被電離, 為提高25(OH)D離子化效率, 獲得更佳的靈敏度, 通常使用PTAD對25(OH)D 進行衍生化反應, 通過反應引入一個含豐富氮原子的基團, 該基團會使衍生化產物在ESI+模式下很容易形成加氫峰[5]。本研究分析DBS樣本, 由于8mm DBS 樣本片中全血含量很少, 使得分析物的量遠低于常規(guī)的血清樣本LC-MS/MS 分析方法, 須使用PTAD 試劑對分析物進行衍生化, 以提高檢測靈敏度。PTAD 與25(OH)D 進行Diels-Alder 反應生成的25(OH)D2和25(OH)D3衍生化產物均存在6S和6R構型, 本方法在流動相添加甲酸銨或甲酸, 調節(jié)流動相比例及流速, 實現6S和6R構型的分離(圖1), 獲得了更佳的分離度、保留時間和峰形, 提高了分析的準確度。優(yōu)化后選擇流動相為甲醇(含0.1%甲酸)-水(0.1%甲酸、2mM甲酸銨，80:20，V/V), 洗脫時間為7min。對于25(OH)D衍生化產物存在的6S 和6R 兩種構型, 為方便定量, 選擇主峰6S 構型進行定量分析。PTAD衍生化產物在質譜環(huán)境中，容易失去一分子水，形成的準分子離子脫水峰是該衍生物ESI一級質譜的主峰，因此，MRM定量分析時選擇[M+H-H2O]+作為母離子。

圖1 25(OH)D3衍生化過程

提取試劑優(yōu)化：本研究方法優(yōu)化了從DBS樣本從提取25(OH)D提取率；分別使用了乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷4組從DBS樣本從提取25(OH)D。同條件下比較甲醇組的提取效率相對較高。對甲醇組繼續(xù)優(yōu)化，分別對照了提取時間30min和15min，兩個時間段無明顯差異；對甲醇組用水分別配置20%、40%、60%、80%、100%比例的濃度進行提取無顯著差異。對甲醇組用甲酸分別配置0.1%、0.2%、0.3%、0.5%濃度的比例進行提取對比，結果表明3%甲酸甲醇溶液提取信號峰面積最大。最終確定用0.3%甲酸甲醇溶液作為提取劑在超聲模式下提取15min。

3.2 實驗結果

從DBS樣本測量25(OH)D含量，標準品中25(OH)D2和25(OH)D3的濃度為1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL/、10ng/mL、20ng/mL、100、ng/mL；質控品的濃度為20ng/mL、100ng/mL。全血中分析物25(OH)D2和25(OH)D3和相對應的穩(wěn)定同位素內標25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D3的峰面積比值為y, 濃度為x(ng/mL), 進行線性回歸擬合, 結果表明, 25(OH)D2和25(OH)D3在1～100ng/mL范圍內線性關系良好, 線性決定系數R2均大于0.99(圖2)。

圖2 質譜檢測峰及定量曲線

3.3 DBS樣本中25(OH)D與血清中的換算關系

DBS樣本25(OH)D的含量定量：DBS樣本與血漿維生素D水平的換算公式：(Hematocrit Fraction與性別有關，女性0.41，男性0.45)

目前已經檢測52個DBS樣本。做DBS樣本同時檢測血漿中25(OH)D的含量定量。兩組數據采用配對T檢驗進行統(tǒng)計差異比較，成對樣本相關系數0.983(P<0.01)，成對樣本檢驗統(tǒng)計量t=2.19(P<0.05)，得出結論兩種方法統(tǒng)計學差異度小。

4 結論

本研究建立了一種基于LC-MS/MS 檢測DBS樣本中25(OH)D的方法, 檢測僅需要1個8mm孔徑全血的DBS樣本, 前處理使用PTAD衍生化，以及超聲提取。本方法方便快速, 靈敏度高, 準確度好, 樣本穩(wěn)定性佳, 適用于有限采血條件下的25(OH)D2/D3檢測及相關疾病的大規(guī)模篩查。