趙煥英 隋雷鳴 王俐勇 付文卓 趙君朋

(首都醫(yī)科大學中心實驗室基因組學研究平臺，北京 100069)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超越14000例。近幾年，腦瘤分子標記物檢測逐漸得到重視和開展，并為疾病診斷、預后的估判、及治療方法選取提供有力信息支持，極大推進了原有的單純組織病理學分類方法。其中膠質(zhì)瘤相關(guān)基因中異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)、異檸檬酸脫氫酶2(Isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)基因突變易發(fā)生在年輕膠質(zhì)瘤患者、少突膠質(zhì)細胞瘤及混合性膠質(zhì)瘤，IDH1/2突變的患者預后相對較好[1-3]。組蛋白h3.3和h3.1基因(H3F3A和HIST1H3B)的點突變在小兒彌漫性中線膠質(zhì)瘤中發(fā)生率高達80%，其中在小兒彌漫性高級星形細胞瘤中，組蛋白H3.3基因H3F3A K27M 突變率高于 G34R/V，H3K27M 突變治療反應(yīng)差，生存率低，因此K27M分子可作為鑒別診斷的標準分子之一[4-6]。BRAFV600E和TERT啟動子區(qū)域突變常分別在低分級和高分級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)生[7]，BRAFV600E突變在上皮樣膠質(zhì)母細胞瘤中占比達50%，而在其他類型神經(jīng)母細胞中極少有BRAF的突變，BRAF突變腫瘤侵襲性強，同時也可望成為治療的靶點[8]。TERT啟動子突變是最常見的單基因成人彌漫性膠質(zhì)瘤的突變類型，TERT啟動子區(qū)-124和-146位點常發(fā)生C228T和C250T突變類型，對膠質(zhì)瘤亞型分類有高度特異性，是彌漫性膠質(zhì)瘤的診斷指標[9]。通過文獻查閱，針對以上突變位點的檢測，通常采用免疫組化、一代測序及焦磷酸測序的方法，時間長，成本貴。本實驗旨在建立MassARRAY 質(zhì)譜分析方法同時檢測這些位點，為疾病的診斷和治療提供可行性信息。

1 實驗材料與方法

(1)實驗材料：

40例人腦膠質(zhì)瘤石蠟組織包埋標本，正常人外周血液樣本為陰性對照，生理鹽水空白對照。

(2)主要試劑與儀器：

蛋白酶K(Merk)，核酸提取試劑盒、Lab-Aid 824核酸提取自動提取儀(廈門至善生物科技有限公司)；紫外分光光度計(IMPLEN)；QIAxcel Advanced 毛細管電泳儀(Qiagen)；一代測序儀3730(ThermoFisher)；聚合酶鏈式反應(yīng)試劑盒、MassARRAY清潔樹脂、iPLEX Pro Reagent Kit、MassARRAY Analyzer 4 System 384cpm質(zhì)譜分析儀(Agena)；振蕩混懸儀(Eppendorf)；Allegra 25R臺式冷凍離心機(Beckman)；LightCycler480熒光定量PCR儀(Roche)。

2 實驗方法

2.1 石蠟樣本DNA提取

石蠟樣本經(jīng)二甲苯脫蠟處理后行蛋白酶K 消化至液體狀，于Lab-Aid 824儀器上進行核酸自動提取，方法參見文獻[10]。

2.2 6個基因11位點的檢測引物準備

通過檢索Pubmed 數(shù)據(jù)庫，結(jié)合國內(nèi)外研究進展，統(tǒng)計膠質(zhì)瘤相關(guān)基因突變位點，確定6個候選基因11個位點如下：IDH1-132(rs121913500)、IDH2-172(rs121913503)、IDH2-140(rs121913502)、TERT(-245,rs2853669)、TERT(-124)、TERT(-146)、H3.1-27、H3.3-27(rs1057519902)、H3.3-34(rs1057519903)、H3.3-33、BRAF-600。gene數(shù)據(jù)庫中下載6個基因組序列，標注目的突變位點，選取突變位點前后約200bp堿基序列，編輯引物設(shè)計文檔。利用Agena BioScience軟件設(shè)計擴增引物8對，位點延伸引物11條，延伸引物設(shè)計位于突變位點前一個堿基，與擴增產(chǎn)物互補進行單堿基延伸反應(yīng)，見表1。根據(jù)延伸引物及后續(xù)單堿基分子量不同，把11個檢測位點分成2組見表2，每組分別配置每條引物濃度為0.5 μmol·L-1多重PCR反應(yīng)的混合引物。

2.3 MassARRY反應(yīng)體系

a)多重PCR反應(yīng)：每個樣品配置反應(yīng)體系5 μL，其中濃度為10×PCR緩沖液0.5μL、MgCl2(25 mmol·L-1)0.4 μL、dNTPs(25 mmol·L-1)0.1 μL、PCR 熱啟動酶(5 U·μL-1)0.2 μL、擴增引物混合液1μL、基因組DNA(10 ng·μL-1)1μL，超純水補足至5μL。在兼容384孔板的PCR儀上，進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性2 min；95℃20 s，56℃30 s，72℃ 60 s，共45個循環(huán)：72℃再延伸3 min。

b)PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶(SAP)處理：PCR反應(yīng)結(jié)束，向384 孔反應(yīng)孔中加入2μl SAP 反應(yīng)混合液，密封反應(yīng)孔，于PCR儀上運行程序：37℃ 40 min，85℃ 10min。

c)單堿基延伸反應(yīng)：在384 孔中加入2μL 單堿基延伸混合液及引物，進行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 10min；94℃30 s，56℃30s，72℃1 min，72℃3 min；4℃保存。

2.4 質(zhì)譜檢測及分析

在384 孔中加入16μL 去離子水與6mg樹脂，按操作說明書進行脫鹽處理；后利用MassARRAY Nanodispenser RS 1000點樣儀轉(zhuǎn)移至384孔芯片上，自然干燥后上機，運行MALDI-TOF質(zhì)譜程序，采用MassARRAY TYPER4.1軟件(Agena)進行基因型判讀。

3 結(jié)果與討論

3.1 多重PCR引物的篩選

MassARRAY原理為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)。主要特點是：PCR擴增后的產(chǎn)物，加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點上，延伸 1個堿基。然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，后置入質(zhì)譜儀的真空管，于瞬時納秒(10-9s)強激光激發(fā)，基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量，使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)電荷離子，離子在加速電場中獲動能，按照其質(zhì)荷比率加以分離，離子飛行時間與離子質(zhì)量成反比。通過檢測離子在真空管飛行到檢測器的時間精確物質(zhì)分子量，從而檢測出SNP位點信息，基于飛行管長度限制，MassARRAY SNP 檢測的分子量范圍為5000～8500 Dalton。檢測基于多重PCR方法，一管反應(yīng)體系中引物數(shù)量多，這要求引物間避免互補，尤其需絕對避免延伸引物3’端與其他引物有超過3個堿基的互補。否則易造成非特異延伸，出現(xiàn)錯誤檢測結(jié)果。為了保證PCR擴增效率，PCR擴增產(chǎn)物長度一般不超200bp，還需遵循其他PCR引物設(shè)計原則(避免形成二聚體/錯配等)[11]。利用Agena BioScience軟件篩選出的8對擴增引物，擴增片段長度在71bp～121bp之間，如表1。引物前端添加與人類基因無關(guān)的標簽序列ACGTTGGATG，目的增加引物分子量使其大于8500Da，超過質(zhì)譜檢測限，避免對延伸引物及產(chǎn)物產(chǎn)生干擾。

表1 6個基因的11個待檢位點的擴增引物序列信息

3.2 延伸引物及分子量范圍

根據(jù)延伸引物及延伸一個堿基后分子量不同，基質(zhì)輔助激光解吸后電離飛行到檢測器的時間不同，分子質(zhì)量小的先到達，質(zhì)譜峰先出現(xiàn)。11個位點的延伸引物信息如表2，第1組5個位點組合，分子量范圍為4844.2Da～7923Da；第2組6個位點組合，分子量范圍為4833.1Da～8367.3Da。

表2 11個待檢位點的延伸引物及產(chǎn)物序列信息

3.3 兩組突變位點的質(zhì)譜檢測

每個樣品經(jīng)過兩組多重PCR擴增及延伸反應(yīng)后，分別在芯片上進行點樣，激光解吸后電離。圖1是第1組前5個位點的質(zhì)譜分離圖，可以看出延伸后的分子量從5115.4Da～7923Da 之間；圖2是第2組后6個位點質(zhì)譜分離圖，分子量在5080.3Da～8367.3Da區(qū)域。在質(zhì)譜圖上，每種顏色區(qū)域是一個基因位點的檢測區(qū)域，根據(jù)出現(xiàn)的野生型和突變型的峰面積數(shù)據(jù)，能夠定量判讀突變比率。

圖1 前5個基因突變位點的質(zhì)譜圖型

圖2 后6個基因突變位點質(zhì)譜圖型

3.4 與一代測序結(jié)果比較

一代測序技術(shù)是熒光標記測序法，儀器通過檢測ddNTP上的熒光來讀取所測序列，熒光染料會干擾測序引物相鄰的幾十個堿基信號，導致無法讀出序列，加之引物本身不含熒光，都是沒信號的部分，這也要求設(shè)計引物時引物序列需距檢測的目標位點最少60bp以上；且測序前需純化回收PCR片段，為了保證回收效率，擴增的PCR片段長度不易低于200bp。與MassArray技術(shù)不同，引物前無需加標簽序列，其他仍需遵循引物設(shè)計原則。兩種技術(shù)檢測結(jié)果見表3，突變位點檢測一致率為96.4%，有2例樣本1號和2號分別在H3.3和IDH1兩個指標檢測中結(jié)果不一致。如圖3、圖4是1號樣本兩種方法檢測結(jié)果，從質(zhì)譜圖上可見H3.3(27)這個位點發(fā)生了A/T突變，分子量在5171.3處的T峰面積約為13，分子量5114.4處的A峰面積約為125；而圖4一代測序所示無突變。同樣圖5、圖6是2號樣本檢測結(jié)果，圖5 質(zhì)譜圖上顯示IDH1(132)位發(fā)生A/G堿基突變，A峰面積約84，G峰面積324，根據(jù)峰面積可計算突變比率；圖6箭頭所示背景峰高，無法判斷是否發(fā)生突變。表4示40例樣本在IDH1和H3.3兩個位點檢測結(jié)果比較，可知MassARRAY靈敏度能達100%，與一代測序檢測的真陰性數(shù)據(jù)相比62/64，特異度約97%。造成這種差異的原因與一代測序技術(shù)靈敏度低，大于20%以上的突變才能被檢測到有關(guān)[12]。測序反應(yīng)的信號強弱除與模板量有關(guān)，還與同一位置不同堿基信號強度不同有關(guān)；這會導致即使突變的模板所占的比例較高時，也不一定能準確檢測到突變的存在。另外，測序儀軟件對掃描結(jié)果處理時，一般會將信號弱的峰做為背景信號處理，進一步壓低弱的峰，提高主峰，因此對低含量的突變不易檢測，高含量突變檢測到也不能定量判讀。且高GC、重復序列，復雜二級結(jié)構(gòu)的DNA片段對一代測序是個巨大挑戰(zhàn)，普通PCR條件很難擴增出單一目的條帶，需利用高效熱啟動酶，梯度PCR程序及多對引物優(yōu)化才能擴增出目的條帶[13，14]，測序時需添加變性劑優(yōu)化測序信號。質(zhì)譜方法中因擴增的PCR片段短，可避開一些復雜二級結(jié)構(gòu)；延伸引物只需延伸一個堿基后進行質(zhì)譜鑒定其分子量。另外 MassARRAY 系統(tǒng)反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，無需各種標記。與芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，使得它具備高度特異性、靈敏度和高精確度[15]。能夠以快速精確的進行基因型識別，直接測出帶有SNP 或其他突變的目標DNA[16]。

圖3 MassARRAY檢測1號樣本H3.3-27位點A/T 突變

圖4 一代測序檢測1號樣本H3.3-27位點的結(jié)果

圖5 MassARRAY 檢測到的2號樣本IDH1-132位點A/G突變

圖6 一代測序檢測2號樣本IDH1-132結(jié)果

表3 MassARRAY 和一代測序?qū)?0例樣本檢測結(jié)果

表4 40例樣本IDH1和H3.3 兩種測方法比較

4 結(jié)論

目前腦膠質(zhì)瘤的病理分級和分型，常采用的是免疫組化或一代測序方法進行突變檢測；在臨床基因檢測方面，因多個單基因分次檢測的復雜性和穿刺等來源標本總量不足，成為多基因同時檢測的限制因素。基于二代測序平臺的高通量檢測也因建庫、測序及分析等專業(yè)化及價格貴還不能普及應(yīng)用于臨床檢測。MassARRY技術(shù)通過擴增延伸反映與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，只需10ng DNA 樣本可理論上就可實現(xiàn)多達40個基因同時檢測，無需熒光標記；而一代測序需要每個基因單獨擴增，極大增加了檢測樣本量和成本。MassARRY在定量分析基因突變檢測中檢測基因數(shù)量，除受基因分子量影響，也受PCR擴增引物及引物增加的多個堿基前綴影響，尚需多次嘗試多對引物組合，建立合適的基因配伍檢測集合。