張宇，沈雪，吳青青，方宗宇，馬莉

1 貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽550004；2 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院

強直性脊柱炎(AS)是以中軸脊柱和骶髂關節(jié)受累為主的一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，可伴發(fā)關節(jié)外表現，嚴重者可發(fā)生脊柱畸形和關節(jié)強直，其確切的病因及發(fā)病機制至今尚未清楚[1]。大量研究[2，3]表明，免疫功能異常與AS發(fā)病密切相關，尤其以CD4+T細胞亞群紊亂最為顯著。調節(jié)性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)是近年來研究較多的CD4+T細胞亞群，Treg/Th17細胞亞群比例或功能失衡在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。白細胞介素-35(IL-35)是一種主要由Treg細胞分泌的抑制性細胞因子，屬于IL-12家族新成員，由α亞基IL-12 p35和β亞基EB病毒誘導基因3(EBI3)經二硫鍵結合形成[4]。作為一種新型抑制性細胞因子，IL-35可通過促進Treg細胞增殖、抑制Th17細胞分化和IL-17分泌參與機體免疫調節(jié)作用。研究[5～7]發(fā)現，IL-35在多種免疫介導性疾病中發(fā)揮重要作用，如炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、變應性鼻炎等。IL-17是主要由Th17細胞分泌、具有促進炎癥發(fā)展的特異性細胞因子，可以促進白細胞的遷移和活化，在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮著重要作用[8]。目前關于IL-35和IL-17在AS疾病發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報道。本研究觀察了AS患者血清IL-35、IL-17水平變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月～2019年3月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收治的AS患者77例，記為AS組，男67例、女10例，年齡14～48歲，年齡(28.61±8.26)歲，病程1個月～32年，病程(5.62±5.80)年，人類白細胞抗原B27(HLA-B27)均為陽性，采用Bath AS疾病活動指數(BASDAI)評分表對AS患者進行評分，平均(3.49±1.57)分。77例患者均符合美國風濕病協會(ACR)1984年修訂的AS診斷標準[9]且未接受過激素、抗風濕藥物及生物制劑等治療。另選取同期體檢健康者59例作為正常對照組，男44例、女15例，年齡19～42歲，年齡(27.40±5.01)歲，所有健康體檢者均無自身免疫疾病史、近期感染史，心肝腎功能均正常。兩組研究對象在年齡、性別等一般資料方面均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。排除標準：合并其他免疫相關性疾病、血液系統(tǒng)疾病、心肝腎功能嚴重損害、急慢性感染、妊娠期及哺乳期女性。本研究經貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理學委員會審核批準。研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 HLA-B27試劑盒購自BD公司，ELISA試劑盒購自eBioscience公司，Hs-CRP試劑盒購自德國羅氏公司，流式細胞儀FACSCantoTMⅡ購自美國BD公司，SYM-BIO EGATA2310全自動洗板機、SYM-BIO2510酶標板振蕩器購自上海新波生物技術有限公司，Well Scan K3酶標儀購自芬蘭雷勃公司，羅氏702全自動生化儀購自德國羅氏公司。

1.3 兩組血清IL-35、IL-17檢測 清晨空腹狀態(tài)下采集肘靜脈血5 mL，置于未添加抗凝劑的真空采血管中，3 800 r/min離心15 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-35、IL-17水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 兩組血清炎性活動指標紅細胞沉降率(ESR)、超敏C反應蛋白(Hs-CRP)檢測 清晨空腹狀態(tài)下采集肘靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，采用魏氏法檢測ESR。清晨空腹狀態(tài)下采集肘靜脈血5 mL，置于未添加抗凝劑的真空采血管中，3 800 r/min離心15 min，分離血清，采用散射比濁法檢測Hs-CRP。

2 結果

2.1 兩組血清IL-35、IL-17水平比較 AS組血清IL-35、IL-17水平分別為(20.79±11.26)、(24.19±14.56)pg/mL，正常對照組血清IL-35、IL-17水平分別為(41.09±18.56)、(7.21±4.67)pg/mL，兩組相比，P均<0.05。

2.2 兩組血清炎性活動指標ESR、Hs-CRP水平比較 AS組血清ESR、Hs-CRP水平分別為(22.23±13.59)mm/h、(11.03±11.61)mg/L，正常對照組血清ESR、Hs-CRP水平分別為(7.72±3.28)mm/h、(2.22±1.58)mg/L，兩組相比，P均<0.05。

2.3 AS患者血清IL-35水平、IL-17水平與ESR水平、Hs-CRP水平、BASDAI評分的相關性分析結果 AS患者血清IL-35水平與IL-17水平、ESR水平、Hs-CRP水平和BASDAI評分呈負相關(r分別為-0.327、-0.349、-0.287、-0.353，P均<0.05)，血清IL-17水平與ESR水平、Hs-CRP水平和BASDAI評分呈正相關(r分別為0.389、0.358、0.479，P均<0.05)。

3 討論

AS是一種常見于青年男性的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其確切的病因和發(fā)病機制尚未明確。既往研究[10，11]表明，AS的發(fā)生與CD4+T細胞亞群比例或功能紊亂密切相關，主要表現為Th1/Th2和Treg/Th17細胞免疫失衡以及相關細胞因子表達水平失調，而引起其免疫失衡的機制尚未闡明。

IL-35是最新發(fā)現調控Treg/Th17細胞分化的重要細胞因子，可促進Treg細胞增殖，同時抑制Th17細胞分化及其相關炎性因子IL-17的分泌[12]。有研究[13]發(fā)現，在CD4+T細胞亞群與胰島細胞共培養(yǎng)體系中加入重組IL-35(rIL-35)，能夠促進Treg細胞增殖，抑制Th17細胞分化，調控Treg/Th17比率，提高胰島細胞活性。此外，在膠原誘導的小鼠關節(jié)模型中過繼轉移IL-35能促進Treg細胞增殖，抑制CD4+CD25-細胞增殖、分化，抑制IL-17分泌，并增強干擾素 (IFN- γ)的產生，有效減輕炎癥反應從而改善膠原性關節(jié)炎癥狀[14]。同樣有研究[15]發(fā)現，Treg細胞在刺激后可分泌大量的IL-35，通過對CD4+T細胞的負向調控參與多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征、炎癥性腸病等。因此，我們推測IL-35在AS的發(fā)病過程中可能也發(fā)揮著重要的作用。

IL-17是一種由Th17細胞產生的炎癥性細胞因子，可招募、活化中性粒細胞，誘導T細胞激活和刺激上皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞產生炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-8、IL-1等，進而誘導炎癥產生[16]。已有研究[17，18]表明，IL-17升高與多種慢性炎癥性疾病有關。

本研究結果顯示，AS組患者血清IL-35水平較正常體檢者顯著降低，并且與疾病活動度評分BASDAI呈負相關；而AS組患者血清IL-17水平較正常體檢者顯著升高，與BASDAI評分呈正相關。以上結果提示，血清IL-35變化趨勢與IL-17相反，隨著病情嚴重程度增加，AS患者血清IL-35水平進一步降低，而IL-17水平進一步升高。IL-35水平降低可能誘導Treg細胞增殖和分化的能力減弱，導致AS患者的免疫系統(tǒng)異?；罨陨砻庖吣褪軉适?；同時Th17細胞過度活化，釋放大量IL-17等炎性介質，IL-17可能通過增強炎癥反應而加重疾病進展，從而介導AS疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，在相關性分析中也發(fā)現，AS患者血清IL-35水平與IL-17水平呈負相關，也印證了IL-35對Th17細胞增殖和IL-17分泌的抑制作用減弱。血清IL-35、IL-17水平檢測有可能成為監(jiān)測AS疾病活動度的新指標。

本研究進一步分析發(fā)現，AS患者血清IL-35水平與臨床炎性活動指標ESR和Hs-CRP水平呈負相關，IL-17水平與ESR、Hs-CRP水平呈正相關，我們推測在AS患者中血清IL-35水平降低、IL-17水平升高可能間接通過體內復雜的體液免疫或細胞免疫網絡促進炎性活動指標ESR、Hs-CRP表達水平上調，促進AS炎癥的發(fā)生發(fā)展。但其確切調控機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

綜上所述，AS患者血清IL-35水平降低、IL-17水平升高，血清IL-35水平與IL-17水平、ESR水平、hs-CRP水平和BASDAI評分呈負相關，IL-17水平與ESR水平、Hs-CRP水平和BASDAI評分呈正相關。IL-35水平下降可能會導致Treg/Th17細胞免疫平衡紊亂，促進炎性因子IL-17的產生，進而在AS疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，血清IL-35、IL-17水平檢測有可能成為監(jiān)測AS疾病活動度的新指標，但其具體作用機制還有待進行相關基礎實驗，以進一步深入研究。