陳智毅，潘道延，楊嘉旖，林凱桑，胡世弟，張彤，周凌燕，沈潔

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣州510000

糖尿病慢性難愈性潰瘍是指糖尿病患者由于機體長期慢性高血糖導(dǎo)致皮膚軟組織血運障礙、神經(jīng)病變，在皮膚受損情況下造成3個月以上遷延不愈的創(chuàng)面[1]。針對糖尿病慢性難愈性潰瘍的治療，目前國內(nèi)外缺乏針對性強、效果好的手段[2]。間充質(zhì)干細胞因其具有改建血管、增強下肢血流、修復(fù)糖尿病周圍神經(jīng)病變、調(diào)節(jié)免疫等作用在組織修復(fù)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[3]。但間充質(zhì)干細胞移植固有的全身性風(fēng)險、效率低下、倫理問題亟待解決[4]。研究[5]顯示，外泌體是由多種類型的細胞分泌的多泡內(nèi)涵體與細胞膜融合后釋放到細胞外的一種大小在60～150 nm之間的膜性小囊泡，里面含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、microRNAs、信號分子等多種不同的活性物質(zhì)。外泌體可通過與細胞膜的融合，將其中的遞質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一細胞，從而實現(xiàn)跨細胞信息傳遞并調(diào)節(jié)細胞間信號傳導(dǎo)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。目前多項研究[6～8]表明，基于間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的非細胞治療較細胞移植治療更為安全、便捷，但外泌體治療還存在靶向性不足、作用時間有限等問題。結(jié)合本課題組前期研究，我們認為以水凝膠負載外泌體進行治療是一種可行的思路。本研究構(gòu)建了臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體-溫敏水凝膠，并觀察其溫敏性和侵入性，為糖尿病慢性難愈性潰瘍的治療提供了新思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑 臍帶間充質(zhì)干細胞株Saliai-HMSC(UC)-N由廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司提供，細胞株已經(jīng)完成鑒定，經(jīng)過細菌、真菌、支原體和病毒檢測顯示，該細胞可表達多種干細胞特異性標(biāo)記物，具有良好的增殖分化潛能。人臍靜脈內(nèi)皮細胞株C-12206購自德國PromoCell公司。外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司，Pluronic F-127粉末購自美國Sigma公司。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的提取 取Saliai-HMSC(UC)-N細胞在培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，生長至95%融合時，無菌PSB緩沖液沖洗2次，加入去外泌體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，加入新的去外泌體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每一皿細胞按相同方式收集3次細胞培養(yǎng)上清。將收集的細胞培養(yǎng)上清經(jīng)過40 μm細胞濾網(wǎng)過濾后，分裝于15 mL離心管中，每管分裝量為10 mL，以3 000×g離心15 min，取上清液，按1∶5比例加入外泌體提取試劑，上下倒置3次混勻，4 ℃冰箱中靜置18 h后，以1 500×g離心30 min，棄上清，再以1 500×g離心5 min，移液槍吸凈沉淀之上的液體，視沉淀量加入100～500 μL PBS進行重懸，即得臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體重懸液。

1.3 外泌體-溫敏水凝膠的構(gòu)建 稱取適量提前預(yù)冷的Pluronic F-127粉末，避光條件下按20%、22%、24%、26%、28%的濃度梯度分別加入1 mL濃度為300 μg/μL的臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體重懸液，移液槍在冰浴條件下吹打至混懸狀態(tài)，4 ℃冰箱靜置1 h，待沉淀完全溶解后，即得到20%、22%、24%、26%、28%濃度的外泌體-溫敏水凝膠溶液。

1.4 不同濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的溫敏性測定 ①初始凝膠化溫度測定。開啟恒溫水浴鍋，加入冰塊調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至10 ℃，以10～40 ℃為測量范圍、每次測定溫度間隔0.2 ℃，測定不同濃度(20%、22%、24%、26%、28%)外泌體-溫敏水凝膠溶液的初始凝膠化溫度。②37 ℃初始凝膠時間測定。開啟恒溫水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度至37 ℃，測定不同濃度(20%、22%、24%、26%、28%)外泌體-溫敏水凝膠溶液的37 ℃初始凝膠時間。

1.5 24%濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的侵入性測定 ①首先對外泌體使用PKH67進行標(biāo)記：避光條件下，將250 μL PKH67染色試劑盒C液分別與2 μL PKH67染料以及臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體重懸液混合，隨后將混合后的兩種液體再次混勻，室溫下靜置5 min后加入500 μL 1% BSA終止反應(yīng)；加入200 μL外泌體提取試劑，混勻后于4 ℃冰箱中靜置2 h后以12 000×g離心10 min，保留沉淀，使用PBS清洗去除殘余染液，以2 mL PBS重選，即得到PKH67標(biāo)記的臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體重懸液。參照“1.3”方法，制作PKH67標(biāo)記的24%濃度的外泌體-溫敏水凝膠溶液。②將臍靜脈內(nèi)皮細胞接種到12孔板上，加入等量完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至85%融合，分成2組，即外泌體組、外泌體-溫敏水凝膠組。外泌體組加入1 mL PKH67標(biāo)記的臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體重懸液，外泌體-溫敏水凝膠組加入1 mL PKH67標(biāo)記的24%濃度的外泌體-溫敏水凝膠溶液。兩組細胞于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中避光孵育12 h，避光條件下冰浴吸凈液體，以PBS清洗三遍后滴加稀釋的DAPI細胞核染色液，避光孵育30 min，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。熒光倒置顯微鏡下外泌體呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。③取外泌體組、外泌體-溫敏水凝膠組細胞，隨機選擇4個不同的視野進行拍照，使用Image J軟件計算綠色熒光光密度百分比、綠色熒光面積百分比。綠色熒光光密度百分比=綠色熒光光密度值/藍綠色熒光總光密度值×100%，綠色熒光面積百分比=綠色熒光面積/藍綠色熒光總面積×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的溫敏性測定結(jié)果比較 ①20%、22%、24%、26%、28%濃度的外泌體-溫敏水凝膠溶液的初始凝膠化溫度分別為(17.8±0.7)、(16.6±0.3)、(14.6±0.5)、(13.4±0.3)、(12.4±0.1)℃，各濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的初始凝膠化溫度相比，P均<0.05。②20%、22%、24%、26%、28%濃度的外泌體-溫敏水凝膠溶液的37 ℃初始凝膠時間分別為(92±6)、(79±5)、(68±3)、(51±3)、(46±2)s，各濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的37 ℃初始凝膠時間相比，P均<0.05。溫敏性測定結(jié)果說明，本研究成功構(gòu)建了臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體-溫敏水凝膠，具有良好的溫敏性。通過對不同濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的初始凝膠化溫度、37 ℃初始凝膠時間比較可知，若將外泌體-溫敏水凝膠應(yīng)用于動物或者人體時，24%濃度的外泌體-溫敏水凝膠具有相對可控的凝膠時間與初始凝膠溫度。

2.2 24%濃度外泌體-溫敏水凝膠溶液的侵入性測定結(jié)果比較 ①熒光倒置顯微鏡下可見，外泌體組、外泌體-溫敏水凝膠組綠色熒光點分布在細胞質(zhì)內(nèi)，并于細胞核周圍富集。②外泌體組綠色熒光光密度百分比、綠色熒光面積百分比分別為0.02%±0.01%、0.11%±0.01%，外泌體-溫敏水凝膠組綠色熒光光密度百分比、綠色熒光面積百分比分別為0.21%±0.05%、1.30%±0.12%，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

糖尿病慢性難愈性潰瘍是一種嚴重的糖尿病慢性并發(fā)癥，最常見的臨床表現(xiàn)為糖尿病足潰瘍及糖尿病性壓瘡，目前糖尿病慢性難愈性潰瘍?nèi)狈τ行У闹委熓侄危A(yù)后極差。研究[9]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者的一生中出現(xiàn)糖尿病足的可能性高達15%，而因糖尿病足住院的患者在所有糖尿病住院患者中占47%。糖尿病慢性難愈性潰瘍形成后很難完全愈合，20%的患者最終面臨截肢，有截肢適應(yīng)證的糖尿病患者5年死亡率也高達39%～80%，治療難度極大。Redd等[10]認為，糖尿病足難以愈合的一個主要因素是創(chuàng)口的血管生成受阻。在基礎(chǔ)研究[11]中發(fā)現(xiàn)，血管的節(jié)段性病變以及毛細血管網(wǎng)的衰減將導(dǎo)致血流變差，從而影響創(chuàng)面的愈合。從這個角度而言，針對糖尿病慢性難愈性潰瘍創(chuàng)面，恢復(fù)血流供應(yīng)以及毛細血管網(wǎng)的功能是治療的核心。

間充質(zhì)干細胞為目前糖尿病慢性難愈性潰瘍治療手段稀缺的局面開創(chuàng)了新的思路。已經(jīng)有相當(dāng)多的基礎(chǔ)以及臨床研究[12]證明，在糖尿病慢性難愈性潰瘍治療領(lǐng)域，間充質(zhì)干細胞具有極其優(yōu)秀的效果及獨特的優(yōu)勢。外泌體的主要作用是實現(xiàn)細胞間的溝通并進行調(diào)控。目前已有多項研究[6]表明，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在組織修復(fù)中具有優(yōu)秀的效果，甚至認為間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在組織修復(fù)的效果等同于乃至強于間充質(zhì)干細胞移植。但目前很少有研究將外泌體用于治療，這是由外泌體的特性所決定的。一方面，幾乎所有的細胞都會對外泌體進行攝取，靜脈輸注難以到達目的細胞，靶向性極差；另一方面，室溫情況下外泌體會迅速膨脹、失效，局部輸注或者外敷效果很差。由此，結(jié)合我們團隊的前期研究[13]，本研究應(yīng)用了Pluronic F-127作為載體構(gòu)建了外用的新型臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體-溫敏水凝膠并對其物理特性及效果進行了初步評估。本研究首先培養(yǎng)了臍帶間充質(zhì)干細胞，按照特定流程收集培養(yǎng)上清，隨后使用沉淀試劑盒對外泌體進行提取，獲得白色沉淀，對沉淀進行重懸后，獲得外泌體重懸液。溫敏特性測定的結(jié)果表明，隨著外泌體-溫敏水凝膠濃度的增加，初始凝膠化溫度以及37 ℃初始凝膠時間均會隨之降低，表明新構(gòu)建的復(fù)合水凝膠具有溫敏特性，這表明在低溫下外泌體-溫敏水凝膠保持液體狀態(tài)，在應(yīng)用到人體后可以迅速凝固成半固態(tài)，應(yīng)用到糖尿病慢性難愈性潰瘍這種可能合并竇道的不規(guī)則傷口中，可以提供支持以及完全填充難以發(fā)現(xiàn)的深部傷口。

外泌體-溫敏水凝膠溶液的侵入試驗中，可見外泌體組以及外泌體-溫敏水凝膠組均出現(xiàn)綠色熒光，高倍鏡下可見綠色熒光出現(xiàn)在細胞核周圍，半定量分析結(jié)果表明，經(jīng)細胞核面積校正的外泌體-溫敏水凝膠組的綠色熒光面積百分比與光密度百分比均高于外泌體組，表明外泌體-溫敏水凝膠比單純的外泌體具有更好的外泌體侵入效果?？紤]到外泌體在室溫下迅速失去治療效果的特點，我們認為溫敏性水凝膠主要通過延長外泌體的作用時間、延緩?fù)饷隗w的失活從而達到更好的侵入效能。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體-溫敏水凝膠，具有良好的溫敏特性和侵入特性。干細胞移植尚存在一系列的缺陷，其本身就具有一定的風(fēng)險，免疫排斥、誘導(dǎo)畸形、誘導(dǎo)癌癥以及肺栓塞的風(fēng)險一直存在[14]。而外泌體直接用于治療則存在作用時間嚴重不足、靶向性不夠等問題。采用溫敏水凝膠作為支架對臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體進行移植，目標(biāo)是打破常規(guī)干細胞移植以及傳統(tǒng)外泌體治療的局限性，為干細胞的臨床使用提供新的思路，提高干細胞應(yīng)用的有效性和安全性，也為外泌體的臨床應(yīng)用打開一條新的出路，這表明了臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體-溫 敏水凝膠具有良好的臨床應(yīng)用前景，但這仍需更進一步的動物實驗?zāi)酥僚R床試驗來進一步驗證。