程麗麗

(臺(tái)州市椒江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局，浙江 臺(tái)州 318000)

對(duì)常用抗生素產(chǎn)生耐藥性已經(jīng)引起普遍的關(guān)注，其中大腸桿菌的耐藥性研究更為普遍。目前研究多集中在對(duì)耐藥譜的調(diào)查，并廣泛運(yùn)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行耐藥機(jī)理的研究，而對(duì)細(xì)菌耐藥性的流行病學(xué)研究較少[1-3]。本研究對(duì)用藥習(xí)慣和用藥頻率存在較大差異的甲乙兩個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌進(jìn)行了17種抗菌藥物的敏感性測(cè)試，以期探索細(xì)菌耐藥性形成的一些規(guī)律，為減少耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)豬場(chǎng)的選擇 選取甲乙兩個(gè)具有代表性的規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)。甲場(chǎng)建于2003年5月，由于出現(xiàn)過較大的疫情，因此頻繁進(jìn)行預(yù)防性用藥。對(duì)仔豬拉稀的治療原來有使用過氯霉素，現(xiàn)在主要以慶大霉素、恩諾沙星等藥為主，同時(shí)四環(huán)素類抗生素、磺胺類抗生素、阿莫西林、先鋒Ⅳ等藥現(xiàn)在經(jīng)常用于飼料添加。乙場(chǎng)建于2005年年底，由于豬場(chǎng)建筑設(shè)計(jì)比較合理，飼養(yǎng)管理水平較高，豬場(chǎng)到目前為止未有大的疫情出現(xiàn)，預(yù)防性用藥很少，對(duì)仔豬拉稀的治療主要以恩諾沙星等藥為主。

1.2樣本采集 以滅菌棉簽采集仔豬新鮮拉稀糞便共36個(gè)樣本，將采集的標(biāo)本置于滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中保存，其中甲場(chǎng)19個(gè)樣本，分離到菌株75株，乙場(chǎng)17個(gè)樣本，分離到菌株67株。

1.3細(xì)菌的分離與純化 把營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管中的糞便標(biāo)本，用無菌接種棒挑取菌液接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落后，挑取典型的單個(gè)菌落，接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察形成紫黑色有或沒有金屬光澤的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌，單在或成對(duì)。

1.4細(xì)菌鑒定及保存 采用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。將分離純化的可疑大腸桿菌菌株接種于系列細(xì)菌生化編碼微量鑒定管內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h后，對(duì)細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判斷并編碼，按編碼值檢索腸桿菌科細(xì)菌生化編碼表即可獲得結(jié)果，對(duì)不確定菌株進(jìn)一步補(bǔ)充生化反應(yīng)予以判定。經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為大腸桿菌者，在新鮮菌液中加入滅菌甘油制成10%(v/v)甘油菌，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的K-B法進(jìn)行[4]。首先在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于2 ml普通肉湯管內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18 h后，用MH肉湯調(diào)制菌懸液，使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫取Ｓ脺缇奘米吁慈≌{(diào)制好的菌懸液，均勻涂抹在MH瓊脂平板上，涂好后放置3～5 min，待培養(yǎng)基表面水分吸干后，即用無菌眼科鑷將藥敏紙片貼于平板上，各紙片中心相距>24 mm，紙片距平板內(nèi)緣>15 mm。37℃培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果。

1.6細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照NCCLS(1999)公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)3種形式對(duì)抑菌圈大小作出解釋，判定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1甲乙兩豬場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況及比較 甲乙兩豬場(chǎng)分離的大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥情況分別如表2和表3所示。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，在各類抗菌藥中，從兩個(gè)豬場(chǎng)分離到的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明等常用抗生素的耐藥率較高，對(duì)已經(jīng)禁用的氯霉素仍然有高的耐藥率，對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素耐藥率較高，而同類的鏈霉素和丁胺卡那則較敏感。值得引起注意的是氟喹諾酮類抗生素在本次試驗(yàn)中表現(xiàn)出比較高的耐藥率，而細(xì)菌對(duì)臨床少用的抗生素如多粘菌素、氨曲南、頭孢哌酮等藥物的敏感性較高。

對(duì)兩個(gè)場(chǎng)大腸桿菌的耐藥譜進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。雖然兩個(gè)場(chǎng)建場(chǎng)時(shí)間不同，藥物使用習(xí)慣和使用頻率存在較大差異，但兩場(chǎng)的細(xì)菌耐藥譜卻比較一致，許多情況下僅為耐藥程度的差別。總體來說，甲場(chǎng)分離的細(xì)菌對(duì)各種抗生素表現(xiàn)出較高的耐藥率，一些在乙場(chǎng)非常敏感的抗生素，在甲場(chǎng)已經(jīng)表現(xiàn)出一定程度的耐藥。比較其他學(xué)者的研究成果[5-6]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在不同的環(huán)境下對(duì)氨芐青霉素、阿莫西林、氯霉素、復(fù)方新諾明和四環(huán)素類藥物都比較容易產(chǎn)生較高水平的耐藥，而且這種耐藥性一般來說比較持久。

圖1 甲乙兩豬場(chǎng)多重耐藥性比較

表2 甲場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況

表3 乙場(chǎng)大腸桿菌耐藥情況

2.2甲乙兩豬場(chǎng)大腸桿菌多重耐藥情況及比較 通過比較甲場(chǎng)分離到的75株細(xì)菌和乙場(chǎng)分離到的67株細(xì)菌的多重耐藥性(圖1)可見，兩個(gè)場(chǎng)的細(xì)菌多重耐藥情況比較接近，乙場(chǎng)分離細(xì)菌6重耐藥以下的細(xì)菌數(shù)(27株占40.3%)，明顯多于甲場(chǎng)(18株，占24.0%)，提示藥物使用頻率和程度對(duì)細(xì)菌多重耐藥的形成有直接的影響。從圖中可以了解到目前養(yǎng)殖場(chǎng)分離的大腸桿菌普遍存在對(duì)抗生素的多重耐藥現(xiàn)象，本試驗(yàn)中許多細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素、氨芐青霉素、阿莫西林以及阿莫西林/棒酸合劑的共同耐藥，因此0-4重耐藥菌所占比例很小(乙場(chǎng)占31.3%，甲場(chǎng)占18.7%)，6重耐藥細(xì)菌最多(乙場(chǎng)10株占14.9%，甲場(chǎng)14占18.7%)。同時(shí)一些細(xì)菌又發(fā)展出對(duì)氨基糖苷類或氟喹諾酮類藥物的耐藥性，所以6-10重耐藥細(xì)菌成為分離細(xì)菌的主體(乙場(chǎng)40株占59.7%，甲場(chǎng)57株占76.0%)。本試驗(yàn)中的10重耐藥以上的細(xì)菌(對(duì)臨床常用抗生素都耐藥的細(xì)菌)所占比例較高(乙場(chǎng)占11.9%，甲場(chǎng)12株占16.0%)，應(yīng)該引起高度重視。

3 討論

3.1藥物使用頻率與耐藥率的關(guān)系 四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素在新場(chǎng)使用較少，但試驗(yàn)結(jié)果卻表明細(xì)菌對(duì)這兩種抗生素有較高的耐藥率，這可能與引進(jìn)種豬體內(nèi)攜帶的耐藥菌群有關(guān)，據(jù)了解，乙場(chǎng)的原種場(chǎng)建場(chǎng)時(shí)間為1998年。該結(jié)果表明對(duì)這兩種抗生素已經(jīng)形成耐藥的細(xì)菌，即使停藥較長(zhǎng)時(shí)間也不容易恢復(fù)到敏感狀態(tài)。

3.2抗生素的交叉耐藥性 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株表現(xiàn)出了對(duì)同類抗生素的交叉耐藥性，這在氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)的特別明顯，環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星都是氟喹諾酮類抗生素，近年來其耐藥率有不斷積累的趨勢(shì)。本次試驗(yàn)表明臨床分離的大腸桿菌已經(jīng)有相當(dāng)程度的耐藥率。有文獻(xiàn)報(bào)道氧氟沙星在該類抗生素中較少誘導(dǎo)出耐藥菌[7]，本次試驗(yàn)可能是由于交叉耐藥現(xiàn)象的存在，結(jié)果顯示臨床分離細(xì)菌對(duì)氧氟沙星的耐藥率也比較高。因此，獸醫(yī)臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地使用，同時(shí)要首先選用不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的藥物，而且必須經(jīng)常更換抗生素種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。

目前，獸醫(yī)臨床上抗生素的廣泛、長(zhǎng)期使用導(dǎo)致許多菌種的耐藥性增強(qiáng)，這不僅給控制和治療疾病帶來困難，而且加劇了抗生素在畜禽體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重危害動(dòng)物食品安全[8]。面對(duì)世界上對(duì)抗生素在食品動(dòng)物上使用的限制日益嚴(yán)格的趨勢(shì)，加強(qiáng)開發(fā)抗生素替代產(chǎn)品成為必然，其中中草藥以其低毒性、低殘留、不容易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性等特點(diǎn)，成為許多研究的熱點(diǎn)，今后仍然有必要加強(qiáng)這方面的研究[9]。同時(shí)，面對(duì)日益嚴(yán)重的耐藥性問題，獸醫(yī)臨床有必要定期對(duì)豬場(chǎng)的常見病原菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，而且要加強(qiáng)耐藥性的流行病學(xué)研究，對(duì)目前在飼料中廣泛添加阿莫西林、磺胺類、四環(huán)素類藥物的有效性有必要進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)。