張 成，姚興東，雷福厚

（廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530001）

巖黃連是罌粟科紫堇屬多年生草本植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting)的全草，又名巖連、土黃連，主要分布于廣西、湖北、甘肅、四川、貴州、云南等地[1]，是廣西本地應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)壯藥。廣西民間用其根消腫止痛、拔毒，治療疥瘡腫毒、肝炎、肝硬化及肝癌等[2]。研究顯示，巖黃連中的主要有效成分是生物堿類化合物，具有抗炎抗菌、鎮(zhèn)痛、保肝、安定、抗肝炎病毒、抗腫瘤等作用[3]。目前對巖黃連的系統(tǒng)研究尚不多見，主要原因是巖黃連的資源較稀缺，不易獲取。本文對巖黃連的化學(xué)成分和生物堿的提取與分離，以及藥理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行簡單的歸納總結(jié)，以期為巖黃連的深入研究與開發(fā)提供更多參考。

1 植株形態(tài)與分布

巖黃連屬罌粟目罌粟科，為多年生草本植物，全株無毛。植株高15～40cm，主根發(fā)達(dá)。莖1～3條，叢生，軟弱，葉具長柄，葉片輪廓三角狀卵，二回羽狀全裂，總狀花序頂生或與葉對生，長7～14cm，苞片橢圓形至披針形，蒴果圓柱狀，略彎曲，種子多數(shù)圓形，種阜杯狀，包住種子一半。巖黃連主要分布于廣西、貴州、云南、湖北、四川等省，在廣西多見于桂西及桂西北等地，在東蘭、巴馬、鳳山等縣分布較多[4]。

2 有效化學(xué)成分

迄今為止，從巖黃連中分離出來且得到研究的化學(xué)成分以生物堿類為主。巖黃連中的生物堿主要為四氫原小檗堿型、小檗堿型、阿樸菲型、血根堿型芐基異喹啉類生物堿[5]?？络腌隱6]用pH梯度分離法，在強堿性部位分離得到小檗堿[berberine]及脫氫卡維丁[dehydrocavidine]；弱堿性部位經(jīng)硅膠低壓柱層析及制備性薄層層析，得到卡維丁[(±)cavidine]、β-羥基刺罌粟堿 [(-)13β-hydroxystilopine]、延 胡 索 甲 素 [(+)tetrahydropalmatine]、(-)四 氫 非洲防己胺[(-)tetrahydrocolumbamine]、白屈菜紅堿[chelerythrine]、(-)斯庫來堿 [(-)scoulerine]、原阿片堿[protopine]等7種不同的生物堿。此后又在巖黃連中發(fā)現(xiàn)了白蓬葉堿[(+)thalictrifoline][7]。周元瑤[8]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法，檢測發(fā)現(xiàn)巖黃連中含有沙明堿(corysamine)、黃連堿(coptisine)、非洲防己堿(columbamine)、去氫碎葉紫堇堿(dehydrocheilanthifoline)。王奇志等[9-10]報道了巖黃連中含有刺檗堿(oxyacanthine)、別隱品堿(allocryptopine)、巴馬汀(palmatine)等生物堿以及胡蘿卜苷(daucosterol)、白樺脂醇(betulin)、白樺脂酸(betulinic acid)、齊墩果酸 (oleanolicacid)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、環(huán) 桉 烯 醇 (cycloeucalenol)、β-香 樹脂醇乙酸酯(β-amyrin acetate) 等10種新化合物。Huang等[11]用甲醇進(jìn)行提取，采用硅膠色譜法和高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，從巖黃連中分離出(+)硝基金剛烷胺、小檗堿、巴馬汀、脫氫卡維丁和血根堿等12種異喹啉生物堿，其中包括2個新的含硝基四氫小檗堿。何志超等[12]用70%乙醇，從巖黃連全草提取得到16個化合物，其中氫化小檗堿、碎葉紫堇堿、去氫碎葉紫堇堿、去氫分離木瓣樹胺、深山黃堇堿等5種化合物為新分離的化合物。吳揚[13]采用高效制備液相色譜技術(shù)，對巖黃連總堿進(jìn)行分離純化，首次從巖黃連中分離得到藥根堿。毛宇昂[14]通過制備液相和柱層析，獲得了3種新化合物：十四-氨基-二十七烷、十四-氨基-二十八烷、膽甾醇。

從已報道的文獻(xiàn)看，目前公認(rèn)的巖黃連的有效成分是生物堿，其中含量較高的3種生物堿小檗堿、巴馬汀、脫氫卡維丁被認(rèn)為是主要的活性組分，研究最多，其結(jié)構(gòu)式見圖1。值得注意的是，脫氫卡維丁[15]是巖黃連所特有的季銨堿類化合物，具有明顯的保護(hù)肝組織及抗肝纖維化的作用，以及抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用，其藥理作用和分離分析方法研究是巖黃連研究中的熱點。

圖1 巖黃連中3種主要生物堿的結(jié)構(gòu)

3 巖黃連的主要藥理作用

3.1 抗菌

巖黃連中的主要有效成分是以脫氫卡維丁為代表的生物堿類化合物。脫氫卡維丁類生物堿對革蘭氏陽性菌、白喉桿菌、乙型溶血性鏈球菌等有明顯抑制作用[16]。丘倩倩[17]在體外培養(yǎng)革蘭氏陽性菌和陰性菌，用巖黃連總堿進(jìn)行抑菌、殺菌實驗，結(jié)果表明，巖黃連總堿對常見的9種革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制和殺菌效果。葉琦莉[18]通過革蘭氏陽性菌和陰性菌的實驗，驗證了巖黃連中的脫氫卡維丁對革蘭氏陽性菌有一定的抑制作用。

3.2 消炎

肖萍[19]采用機(jī)械損傷法，用大腸埃希菌、白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌的混合菌建立起慢性盆腔炎模型大鼠，給予3個不同劑量的巖黃連栓治療20d，采用Elisa檢測大鼠血清中的超氧岐化酶、腫瘤壞死因子、白介素的表達(dá)水平，實驗結(jié)果表明，巖黃連栓對慢性盆腔炎大鼠有一定的治療和免疫調(diào)節(jié)作用。

李麗[20]使用二甲苯和醋酸，分別進(jìn)行了小鼠耳廓腫脹實驗、毛細(xì)血管通透性增高實驗和小鼠棉球肉芽腫實驗，探討巖黃連的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)巖黃連對小鼠腫脹、毛細(xì)血管通透性增加及小棉球肉芽腫的形成有明顯的抑制作用，表明巖黃連對多種炎癥有明顯的抑制作用。

黃燮南等[21]將50mg·kg-1巖黃連總堿對大鼠進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)能減輕旦清性“關(guān)節(jié)炎”大鼠的足腫脹程度。諸葛明麗等[22]采用小鼠耳腫脹法、小鼠皮內(nèi)色素滲出法和小鼠扭體法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巖黃連直腸栓對巴豆油致小鼠耳腫脹、乙酸致毛細(xì)血管通透性的增加及乙酸腹腔注射致小鼠扭體反應(yīng)，均有明顯的抑制作用。

3.3 抗腫瘤

趙一等[23]發(fā)現(xiàn)，巖黃連總生物堿對小白鼠肉瘤(S180)、小白鼠艾氏腹水癌(EAC)、小白鼠肝癌腹水癌(HAC)及大白鼠癌肉瘤(W256)有較顯著的抑制作用。李金花[24]發(fā)現(xiàn)，巖黃連總堿具有一定的抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且抑制作用與時間和劑量表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。顧福莉[25]將巖黃連注射液應(yīng)用到直腸癌的治療中，結(jié)果顯示，巖黃連注射液能夠提高直腸癌的化療效果，提高機(jī)體細(xì)胞的免疫功能，改善患者的生活質(zhì)量。鞠佳霓[26]將不同濃度的巖黃連水提物作用于肝癌HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巖黃連水提物濃度為1.6mg·mL-1時，48h可表現(xiàn)出對肝癌HepG2細(xì)胞最強的抑制作用。

3.4 抗肝炎病毒

傳統(tǒng)上，巖黃連主要被壯族群眾應(yīng)用于保肝護(hù)肝和治療各類肝病?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，巖黃連的有效成分巖黃連總堿包括脫氫卡維丁、右旋四氫巴馬汀、小檗堿等，可消除肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，對肝膽管有消炎作用，可促進(jìn)膽汁排泄及肝細(xì)胞再生，修復(fù)受損肝細(xì)胞[27]。巖黃連對甲、乙、丙肝炎病毒均有不同程度的抑制和殺滅作用，并能較快地產(chǎn)生抗體，且能有效穩(wěn)定肝細(xì)胞膜和線粒體膜，起到保肝護(hù)肝的作用[28]。

王健[29]將不同濃度的巖黃連提取物作用于感染DHBV的廣西麻鴨，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）法，檢測出使用高濃度巖黃連提取物的麻鴨血清中，DHBV-DNA的含量有降低，表明巖黃連提取物對DHBV導(dǎo)致的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

3.5 保肝

吳方[30]將健康大鼠分為4組，把模型組、巖黃連總組、聯(lián)苯雙酯組進(jìn)行皮下注射CCl4橄欖油溶液，建立慢性肝損傷模型，空白組大鼠皮下注射等體積的橄欖油溶液，每周1次，連續(xù)注射8周，最后1周采集大鼠尿樣。分析結(jié)果顯示，巖黃連總堿能干預(yù)性治療慢性肝損傷的大鼠。

劉旭文[31]通過代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)巖黃連的化學(xué)成分中的樺木酸、P-香樹脂醇乙酸酯和深山黃堇堿可能通過調(diào)節(jié)FXR、COX-2和MMP-1靶點，起到抗肝纖維化的作用。黃興振[32]通過巖黃連提取物對四氯化碳和對乙酰氨基酚所致的急性肝損傷的保護(hù)作用，對大鼠膽汁流量、免疫功能的影響進(jìn)行了研究，同時進(jìn)行了急性毒性實驗。結(jié)果顯示，大劑量的巖黃連提取物能明顯減輕肝組織的受損程度，對由對乙酰氨基酚所致的急性肝損傷也有一定的保護(hù)作用。

4 巖黃連中生物堿的提取和分離方法

生物堿是廣泛存在于自然界的一類含氮有機(jī)化合物，一般具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多呈堿性，可以和酸形成鹽，大多數(shù)有特殊而顯著的活性。

巖黃連所含的生物堿多為季銨類生物堿，易溶于水和醇，因此常見的提取方法是將酸水、醇類與超聲、回流等方法聯(lián)合使用[33]。多數(shù)文獻(xiàn)以脫氫卡維丁與總生物堿的含量為指標(biāo)，來確定巖黃連生物堿提取效率的高低。

王靜[34]以巖黃連中的脫氫卡維丁和總生物堿的含量為指標(biāo)，將乙醇與酸水、回流與滲漉兩種不同的溶劑與提取方法作比較，通過L9(34)正交設(shè)計，確定了使用乙醇、回流法提取巖黃連中的生物堿的工藝條件，并優(yōu)化了醇提工藝，最優(yōu)提取條件為：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取時間2h。在最優(yōu)條件下測得脫氫卡維丁的提取率為0.99%、總生物堿的提取率為3.56%。

李林[35]采用超聲提取巖黃連中的生物堿。將巖黃連藥材粉碎，過0.833mm篩。精密稱取粉末0.1g置于具塞錐形瓶中，精密加入1% HCl的甲醇溶液25 mL，超聲處理40 min，測得廣西產(chǎn)的巖黃連生物堿中脫氫卡維丁的含量為1.35%、總生物堿的含量為4.90%。

李倩霞[36]在用酶處理后再用乙醇回流，提取巖黃連藥材中的生物堿，通過正交實驗優(yōu)化了酶處理工藝的參數(shù)。酶解反應(yīng)的最佳工藝條件為：溫度45℃、酶反應(yīng)時間16 h、pH=5.0、酶用量0.9 %。實驗測得巖黃連總生物堿的提取率為4.83%。

綜上所述，巖黃連中的生物堿用1% HCl的甲醇溶液進(jìn)行回流，超聲提取，所得的生物堿含量較高，且操作簡單，提取效率高。

由于中草藥中有多種生物堿同時存在，一般需根據(jù)各種生物堿的酸堿性、溶解性及特殊官能團(tuán)的差異，對其進(jìn)行分離純化[37-38]。巖黃連中大多數(shù)生物堿的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較為相近，因此難以通過簡單的方法進(jìn)行分離。已報道的分離純化方法主要是柱色譜法和高速逆流分配色譜法。

李倩霞等人[39]以總生物堿和脫氫卡維丁含量為指標(biāo)，研究了6種不同的樹脂對巖黃連總生物堿的吸附能力。結(jié)果顯示，D101型大孔吸附樹脂對巖黃連總生物堿的比吸附量和比洗脫量較高。將巖黃連粗提液與使用D101型樹脂純化后的色譜圖進(jìn)行比較，其色譜峰的數(shù)目及相對峰面積組成基本一致，表明樹脂純化工藝對巖黃連提取液中的化學(xué)成分的影響不顯著。

毛宇昂采用硅膠柱層析和快速硅膠柱層析方法分離巖黃連浸膏，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氨水為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，使用薄層檢測分析各餾分。合并表現(xiàn)相同的餾分，經(jīng)濃縮干燥，得到21個不同的餾分，分別為小檗堿、黃連堿、膽甾醇和原小檗堿類化合物，部分餾分需要進(jìn)一步檢測。

毛春芹等人[40]采用高效液相色譜，從巖黃連中分離出脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿，其色譜條件為：Agilent XDB C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.01 mol·mL-1磷酸二氫鉀水溶液(21∶79)，柱溫30℃，檢測波長347nm，體積流量 1.0 mL·min-1。

吳揚等人用高效液相制備色譜技術(shù)對巖黃連總堿進(jìn)行分離純化，色譜柱為COSMOSIL5C18-MS-Ⅱ(250mm×10mm，5μm)，流動相為甲醇和水（20∶80），流速 2.0 mL·min-1。通過結(jié)構(gòu)鑒定，得到6種生物堿，分別為鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫碎葉紫堇堿、脫氫甲卡維丁、脫氫卡維丁和藥根堿。

蔣偉哲等人[41]用醇-酸水-氯仿體系從巖黃連中提取總生物堿，然后采用制備色譜系統(tǒng)AKTA Explorer 100分離巖黃連堿。色譜條件為：色譜柱600mm×16mm，以安瑪西亞的SOURCE30RPC為柱填充料，流動相為0.2 mol·L-1的Na2HPO4(pH=8.5)-乙腈，梯度洗脫（前40 min乙腈比例由10%升至40%，40 min后為 50%），流速 3mL·min-1，進(jìn)樣量2mL。

梁鎮(zhèn)然[42]利用柱層析分離，將巖黃連醇提物經(jīng)溶劑萃取后的水相提取物，對其中一個餾分采用高速逆流色譜法，以正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水（體積比 0.4∶1.5∶4∶0.4∶5∶0.11）為兩相溶劑系統(tǒng)，得到純度為97.0%的去氫碎葉紫堇堿和純度為90.7%的脫氫異阿樸卡維汀。

程軒軒等人[43]采用高速逆流色譜技術(shù)，以正丁醇-乙酸乙酯-水-甲酸(5∶1∶5∶0.01)和正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶1∶9∶0.05)作為兩相溶劑系統(tǒng)，分離巖黃連中的主要生物堿，最終從巖黃連的粗提物中得到6個純度較高的生物堿。劉朝亮[44]采用高速逆流色譜法，對巖黃連中的脂溶性生物堿進(jìn)行制備分離，溶劑系統(tǒng)為正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶5∶5；1.5∶5∶1.5∶5)、正己烷-醋酸乙酯-甲醇-0.2 mol·L-1鹽酸(1∶3.5∶2.5∶4.5)。上相作固定相，下相作流動相，經(jīng)連續(xù)高速逆流色譜分離,直接從巖黃連的粗提物中得到4個純度較高的脂溶性生物堿。

從文獻(xiàn)的結(jié)果看，采用柱色譜法能夠?qū)追N生物堿進(jìn)行較好的分離。其中高速逆流色譜法的分離效率高，處理量大，分離成本低，有望在今后得到更多應(yīng)用。

5 巖黃連中生物堿分析方法的研究進(jìn)展

巖黃連中所含的生物堿主要為小檗堿、巴馬汀和脫氫卡維丁，3種生物堿均為強堿性季銨類生物堿，不揮發(fā)，極性大，且結(jié)構(gòu)與性質(zhì)非常相似，難以分離。從已報道的分析方法看，有效成分分析一般均采用高效液相色譜法，采用的色譜柱主要是ODS非極性柱，如Agilent XDB C18、SHISEIDO-SPOLAR C18[45]、Lichrosopher-C18、Kromasil C18[46]等。 由 于這幾種生物堿均具有較強的極性，因此采用非極性柱進(jìn)行分離的效果并不理想。筆者曾采用Agilent XDB-C18和 ThermoODS-2hypersil色譜柱，以文獻(xiàn)報道的流動相體系進(jìn)行液相色譜分離實驗，均難以將3種生物堿分開。提高固定相極性，增加生物堿在色譜柱上的保留，有望改善分離效果。近幾年本課題組研究和開發(fā)了幾種弱極性色譜固定相，如核殼型SiO2@松香基高分子（Ru131）液相色譜固定相[47]、核殼型SiO2@松香基高分子（Ru532）液相色譜固定相[48]、松香基手性高分子印跡聚合物等，作為液相色譜固定相[49]和漆酚酯鍵合硅膠液相色譜固定相[50]，對生物堿類極性化合物具有較好的分離效果，表現(xiàn)出較高的應(yīng)用潛力，具有較好的應(yīng)用前景。