朱 婷, 耿 銘, 李慶偉
(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116081;2.遼寧師范大學(xué) 七鰓鰻研究中心,遼寧 大連 116081)
單細(xì)胞測(cè)序(single-cell sequencing,SCS)是指在單個(gè)細(xì)胞水平上,對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀組進(jìn)行的高通量測(cè)序技術(shù)[1].在先前的研究中,常常認(rèn)為生物體同一組織中的群體細(xì)胞具有相同功能.然而,組織細(xì)胞間的異質(zhì)性導(dǎo)致了同型細(xì)胞在基因功能和表達(dá)之間存在不同程度的差異.傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)只能檢測(cè)生物體群體細(xì)胞的整體表達(dá)水平,而非單個(gè)細(xì)胞水平.隨著單細(xì)胞測(cè)序的出現(xiàn),在單細(xì)胞水平上分析同型細(xì)胞基因功能與表達(dá)之間的差異性成為可能.
近年來(lái),單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展日趨完善,實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學(xué)以及基因組和轉(zhuǎn)錄組的平行測(cè)序,其中,以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用最為廣泛.以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)槔?,其大致流程包括:分離單細(xì)胞(通常包括將組織酶解成細(xì)胞懸液);分離后的單個(gè)細(xì)胞被裂解,細(xì)胞內(nèi)的RNA分子被捕獲并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增;基因序列測(cè)序;對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通常包括數(shù)據(jù)批量處理、結(jié)果校正、降維和聚類(lèi)等分析方法[2].2012年,美國(guó)Science雜志成功預(yù)測(cè)了單細(xì)胞研究將成為2013年6大重點(diǎn)研究之首[3-5].盡管單細(xì)胞分析是一項(xiàng)相對(duì)較新的技術(shù),但通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行的單細(xì)胞組學(xué)分析已經(jīng)應(yīng)用于數(shù)百項(xiàng)研究中,并取得了令人興奮的新生物學(xué)發(fā)現(xiàn)[6-9].單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用在發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域[10-12].
從生物個(gè)體或組織中分離單個(gè)細(xì)胞是進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的第一步,也是最為重要的一步.但是單細(xì)胞的分離仍然具有較大難度,主要表現(xiàn)在所分離單細(xì)胞的完整性和純度、單細(xì)胞分離的通量和靈敏度.在實(shí)際操作中,常用的單細(xì)胞分離方法主要有以下5種(表1).
表1 常用的單細(xì)胞分離方法
單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)(single cell genome sequencing)指在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù).主要是將分離的單細(xì)胞全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,以獲得高覆蓋率的完整基因組,通過(guò)高通量測(cè)序揭示群體細(xì)胞與單個(gè)細(xì)胞之間的差異性.
單個(gè)細(xì)胞所含DNA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于任何測(cè)序技術(shù)的核酸量,僅為皮克水平,因此,在進(jìn)行單細(xì)胞基因組測(cè)序前要對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行裂解,再進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增.目前,單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)中,應(yīng)用較為廣泛的有基于熱循環(huán)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增技術(shù)(degenerate oligonucleotide primed PCR,DOP-PCR)[18]、基于等溫反應(yīng)的多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple displacement amplification,MDA)[19]和多重退火環(huán)狀擴(kuò)增循環(huán)技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)[20].其中,最為領(lǐng)先的是MALBAC,該技術(shù)在擴(kuò)增覆蓋率、均一性及靈敏度方面,均有很大提高[21].MALBAC能夠降低PCR擴(kuò)增偏倚,使得單細(xì)胞93%的基因組能夠被檢測(cè)[22].同時(shí),該技術(shù)靈敏度高,對(duì)基因組DNA起始量要求較低,0.5 pg即可進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增均勻性明顯優(yōu)于其他技術(shù).在單細(xì)胞基因組測(cè)序中出現(xiàn)噪音和覆蓋度較低或覆蓋度不完全時(shí),可以通過(guò)檢測(cè)更多單細(xì)胞分析細(xì)胞之間的異質(zhì)性.
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single cell transcriptome sequencing,scRNA-seq)通常被稱(chēng)為單細(xì)胞RNA測(cè)序.該技術(shù)通過(guò)分離單個(gè)細(xì)胞,捕獲它們的轉(zhuǎn)錄本,并生成轉(zhuǎn)錄本映射到單個(gè)細(xì)胞的測(cè)序庫(kù),從而評(píng)估細(xì)胞群體和生物系統(tǒng)的基本生物學(xué)特性[23].scRNA-seq可以在單細(xì)胞水平分析基因表達(dá)情況,其差異分辨率顯著高于批量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,這極大推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展[24].例如,scRNA-seq可用于識(shí)別和表征不同免疫細(xì)胞亞群的狀態(tài),這些免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征使得識(shí)別新的致病因子和確認(rèn)生物標(biāo)志物成為可能[25-26].scRNA-seq還可用于重建發(fā)育“軌跡”,揭示不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞命運(yùn)決定[27].
目前,常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)主要有Smart擴(kuò)增技術(shù)(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)[28]、具有分子標(biāo)簽功能的10×Genomics技術(shù)[29]和線性擴(kuò)增的CEL-seq和CEL-seq2[30]等.其中,Smart-seq和Smart-seq2不僅可以檢測(cè)每個(gè)外顯子的表達(dá)情況,還能夠?qū)Λ@取的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行選擇性剪切分析[31-32].10×Genomics極大地解決了組織群體細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題,并且有助于新細(xì)胞類(lèi)型的發(fā)現(xiàn)[29].最新發(fā)表的多重退火技術(shù)[20]和基于dC尾的定量單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)(MATQ-seq)[33],可以檢測(cè)相同類(lèi)型單個(gè)細(xì)胞之間極小的基因表達(dá)差異,并且通過(guò)提高逆轉(zhuǎn)錄效率增加其靈敏度.
生物個(gè)體的基本遺傳信息儲(chǔ)存在核酸中,4種脫氧核苷酸的排列順序決定了核酸和蛋白質(zhì)的序列.表觀遺傳是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)并使其產(chǎn)生可遺傳的改變,包括組蛋白修飾、RNA干擾、DNA甲基化和染色質(zhì)重塑等[34].通過(guò)在單細(xì)胞水平檢測(cè)全基因組的甲基化水平發(fā)掘高異質(zhì)性細(xì)胞表觀遺傳信息,為探究癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)制[31]和胚胎分化機(jī)制提供了重要依據(jù)[35-36].目前,單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序方法主要有單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序法(single-cell bisulfite sequencing,scBS-seq)[37]、單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序法(single-cell reduced-representation bisulfate sequencing,scRRBS)[38]和三維基因組測(cè)序法(high-through chromosome conformation capture,Hi-C)[39].
2015年4月27日,NatureMethods雜志上發(fā)布了一項(xiàng)備受矚目的技術(shù)——單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測(cè)序技術(shù)(genome and transcriptome sequencing,G&T-Seq)[40].該技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的DNA和RNA平行測(cè)序,揭示單個(gè)細(xì)胞遺傳信息的改變與基因功能之間的關(guān)系[41].G&T-Seq整合的重要意義在于能夠定性且定量地獲取單個(gè)細(xì)胞中基因組和轉(zhuǎn)錄組的所有信息,同時(shí)分析單細(xì)胞基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系,深刻揭示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)遺傳信息指導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控機(jī)制.目前,G&T-Seq主要應(yīng)用在癌癥研究領(lǐng)域,尤其是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC),并且在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞多能性、細(xì)胞分化、細(xì)胞治療以及CRISPR/Cas基因編輯等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[42-43].
隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,極大推動(dòng)了生命科學(xué)領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn),其中,寄生蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域也受益頗多.利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),可以在單細(xì)胞水平上探究寄生蟲(chóng)與宿主細(xì)胞之間的相互關(guān)系,檢測(cè)和鑒定新的寄生蟲(chóng)物種,在單細(xì)胞水平上揭示不同類(lèi)型細(xì)胞對(duì)寄生蟲(chóng)生命周期的影響以及寄生蟲(chóng)引起的宿主免疫應(yīng)答等.下面將主要介紹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在寄生蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用(圖1).
圖1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在寄生蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用Fig.1 Application of single cell transcriptome sequencing in parasitology
在單細(xì)胞測(cè)序還未得到廣泛應(yīng)用之前,定義寄生蟲(chóng)的組織或細(xì)胞類(lèi)型很大程度上只能局限于形態(tài)學(xué)特征,很難破譯其基因結(jié)構(gòu);而通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)則可以獲得單個(gè)細(xì)胞的靶序列,并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析.
在瘧疾傳播方面,處于紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育期(IDC)的瘧原蟲(chóng)停止無(wú)性繁殖,轉(zhuǎn)化為配子體的形式存在.Ngara等[44]開(kāi)發(fā)了基于毛細(xì)管內(nèi)單個(gè)受感染紅細(xì)胞(iRBCs)的分離平臺(tái),并與scRNA-seq相結(jié)合,對(duì)瘧原蟲(chóng)處于IDC的165個(gè)iRBCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析.在IDC期間,通過(guò)對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析將細(xì)胞分為多種轉(zhuǎn)錄狀態(tài).有趣的是,從單個(gè)的iRBC分析中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因標(biāo)記分子,它可以成功地在細(xì)胞水平上區(qū)分無(wú)性階段和有性階段的寄生蟲(chóng),繼而驗(yàn)證了以前未定義的配子細(xì)胞階段特異性基因.Poran等[45]發(fā)現(xiàn)scRNA-seq可區(qū)分惡性瘧原蟲(chóng)的生命周期階段,并捕獲了細(xì)胞分化和細(xì)胞周期相關(guān)的一些關(guān)鍵事件.雖然細(xì)胞特異性功能和基因表達(dá)分析受到了缺乏可用標(biāo)記分子的限制,但通過(guò)高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù),提供了各種類(lèi)型的細(xì)胞、組織或者有機(jī)體的基因表達(dá)情況[46-47],并已經(jīng)被用于三腸渦蟲(chóng)、扁形蟲(chóng)、地中海圓頭渦蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)的高分辨率細(xì)胞圖譜的繪制研究中[48].
由此可見(jiàn),單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在分離寄生蟲(chóng)整個(gè)生命周期的所有表型及其多個(gè)生命周期階段細(xì)胞圖譜的開(kāi)發(fā)方面提供了極大助力,這將擴(kuò)展我們對(duì)寄生蟲(chóng)細(xì)胞類(lèi)型多樣性的現(xiàn)有理解,并為疫苗和藥物開(kāi)發(fā)提供新的候選靶標(biāo).
病原體入侵宿主后,通過(guò)多種致病機(jī)制損傷宿主.與此同時(shí),病原體為維持其在宿主體內(nèi)的生存繁殖,需要通過(guò)各種方式逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊.瘧原蟲(chóng)有一個(gè)復(fù)雜的生命周期,包括許多不同的發(fā)育階段,同時(shí)在宿主中積極逃避宿主免疫.通過(guò)微陣列數(shù)據(jù)集[49]以及scRNA-seq數(shù)據(jù)集[50]的使用,以2 h為間隔檢測(cè)24 h,包括以下發(fā)育時(shí)期:環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、成熟裂殖體以及雌、雄配子體等.scRNA-seq可以檢測(cè)不同生殖階段的群體細(xì)胞,通過(guò)偽時(shí)間分析確定生長(zhǎng)周期中不同細(xì)胞的發(fā)展順序[51].然而,也有一些基因是獨(dú)立于細(xì)胞周期而變化的,它們主要存在于亞端粒區(qū)域[52].
Reid等[53]建立了一種適用于瘧原蟲(chóng)scRNA-seq的新方法,不僅可以區(qū)分不同的細(xì)胞類(lèi)群,還可以探索細(xì)胞與細(xì)胞之間潛在的功能差異,揭示了在傳播階段的不同性別差異表達(dá)的基因家族,它們通常是與逃避宿主免疫和發(fā)病機(jī)制相關(guān)的.在惡性瘧原蟲(chóng)中,var基因家族是通過(guò)細(xì)胞黏附和抗原變異建立慢性感染的關(guān)鍵[54],在雄性中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變異,而在雌性中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄變異.在無(wú)性寄生蟲(chóng)中,2種不同的非編碼var轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)是常見(jiàn)的,并參與維持相互排斥的var基因表達(dá),這對(duì)它們的免疫逃避作用至關(guān)重要[55-56].因此,scRNA-seq還可以為基因家族中互斥表達(dá)基因成員之間的相關(guān)轉(zhuǎn)錄事件提供新見(jiàn)解,如巴貝斯尼亞牛的ves基因家族和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的vsp基因家族[57]等.
先前研究的是宿主的群體細(xì)胞對(duì)寄生蟲(chóng)的免疫應(yīng)答,而通過(guò)scRNA-seq還能夠揭示宿主免疫細(xì)胞應(yīng)答時(shí)的群體細(xì)胞差異性,并進(jìn)一步探究其免疫應(yīng)答時(shí)的分子機(jī)制.細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)通過(guò)控制宿主細(xì)胞的免疫機(jī)制以啟動(dòng)和維持感染.傳統(tǒng)批量獲得的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)掩蓋了寄生蟲(chóng)和宿主細(xì)胞之間相互作用的異質(zhì)性,這些相互作用取決于宿主對(duì)感染反應(yīng)的應(yīng)答、宿主細(xì)胞類(lèi)型、感染類(lèi)型、組織組成等.Fontana等[58]發(fā)現(xiàn)了在CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中,編碼巨噬細(xì)胞刺激因子(MCSF)的基因Csfl在一類(lèi)T細(xì)胞亞群中高表達(dá);感染過(guò)程中CD4陽(yáng)性T細(xì)胞Csfl的選擇性缺失,降低了某些骨髓亞群增殖和活化的能力.其中,最顯著的是淋巴結(jié)CD169陽(yáng)性巨噬細(xì)胞,從而導(dǎo)致感染寄生蟲(chóng)的小鼠恢復(fù)受損.感染過(guò)程中CD169陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的減少也導(dǎo)致寄生蟲(chóng)噬血癥增加和宿主死亡率升高.總的來(lái)說(shuō),在單個(gè)細(xì)胞水平上捕獲病原體和宿主轉(zhuǎn)錄本的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于探究不同感染狀態(tài)之間的關(guān)系非常重要.
最近的研究成功證實(shí)scRNA-seq能夠同時(shí)捕獲病毒[59]或細(xì)菌[60]與宿主的轉(zhuǎn)錄本.雖然宿主-細(xì)菌雙測(cè)序需要捕獲非聚腺苷酸轉(zhuǎn)錄本,但細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)感染宿主-病原體scRNA-seq聯(lián)合應(yīng)用是可行的,而且?guī)缀鯖](méi)有技術(shù)障礙.Swierzy等[61]通過(guò)單細(xì)胞高通量測(cè)序,繪制了受弓形蟲(chóng)菌株感染前后的小鼠細(xì)胞表達(dá)譜,通過(guò)對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等差異表達(dá)基因分析鑒定,發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)與其宿主不同類(lèi)型的細(xì)胞之間存在特異性反應(yīng).因此推測(cè),不同宿主類(lèi)型的細(xì)胞的異質(zhì)表達(dá)以及寄生蟲(chóng)對(duì)它們的適應(yīng)能力可能干預(yù)著寄生蟲(chóng)-宿主的相互作用.
單細(xì)胞測(cè)序廣泛應(yīng)用于個(gè)體發(fā)育、生理代謝、疾病治療等方面.但是該技術(shù)仍處在不斷發(fā)展的階段,還有許多問(wèn)題需要改進(jìn):①在分離單細(xì)胞時(shí),首先要保證單細(xì)胞的完整性,避免在分離細(xì)胞時(shí)可能發(fā)生的細(xì)胞交叉污染等問(wèn)題,才能保證測(cè)序結(jié)果的可靠性與數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性;②在測(cè)序過(guò)程中,核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增效率和信噪比等方面需要進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn);③在scRNA-seq分析中數(shù)據(jù)歸一化和聚類(lèi)分析領(lǐng)域的研究仍不完善;④相比其他技術(shù),單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的成本還相對(duì)很高,限制了其在臨床檢測(cè)、腫瘤研究等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用.相信隨著單細(xì)胞分離技術(shù)、測(cè)序技術(shù)、生物信息處理技術(shù)等環(huán)節(jié)的日臻完善,越來(lái)越多關(guān)于寄生蟲(chóng)學(xué)的新認(rèn)識(shí)和新見(jiàn)解將會(huì)不斷涌現(xiàn),并為該研究領(lǐng)域的拓展和深入帶來(lái)巨大變革.