李菊芬,林 濤,馬國(guó)斌

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201106)

細(xì)菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch,簡(jiǎn)稱(chēng)BFB)是一種嚴(yán)重危害葫蘆科植物的世界性病害[1-3],是影響瓜類(lèi)生產(chǎn)的主要病害之一,其病原為嗜酸菌屬西瓜種(Acidovoras citrulli)[4-5]。 由于細(xì)菌性果斑病菌是典型的種傳細(xì)菌性病害[6-7],如不及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和滅菌處理,種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者和瓜農(nóng)將面臨遭受經(jīng)濟(jì)損失的風(fēng)險(xiǎn)。 建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和行之有效的滅菌處理方法是防控此病的重要手段。 目前,PCR 技術(shù)[8-13]、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)[14]已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè),但在種子處理方面尚缺乏有效的防治藥劑[15]。 本試驗(yàn)以在新疆繁育的攜帶瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌的甜瓜種子為材料,分別進(jìn)行70 ℃、75 ℃、80 ℃干熱滅菌、包衣和70 ℃干熱滅菌+包衣5 種不同的滅菌處理,采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的PCR 體系和實(shí)時(shí)定量PCR 方法分別對(duì)處理后的甜瓜種子帶菌情況進(jìn)行檢測(cè),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行活菌分離鑒定,旨在探索一種既不影響種子發(fā)芽率,又能有效殺滅種帶細(xì)菌性果斑病菌的最佳處理方式,為甜瓜種子的生產(chǎn)和流通提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜(Cucumis meloL.)種子:在新疆繁育的攜帶瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌的‘東方蜜1 號(hào)’甜瓜種子。 供試菌株:由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)所提供的細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株(Acidovoras avenaesubsp.citrulli)。

1.2 方法

1.2.1 帶菌種子的不同處理方法

將帶菌的供試甜瓜種子隨機(jī)分成6 組,每組2 kg,以其中1 組種子為對(duì)照(CK),其他5 組分別進(jìn)行如下5 種不同處理。 處理1:40 ℃處理2 d,50 ℃處理1 d,70 ℃處理3 d,50 ℃處理1 d,40 ℃處理1 d。 處理2:40 ℃處理2 d,50 ℃處理1 d,75 ℃處理3 d,50 ℃處理1 d,40 ℃處理1 d。 處理3:40 ℃處理2 d,50 ℃處理1 d,80 ℃處理3 d,50 ℃處理1 d,40 ℃處理1 d。 處理4:包衣處理(包衣劑為衛(wèi)福,有效成分為萎銹靈200 g∕L、福美雙200 g∕L)。 處理5:處理1 +處理4。

1.2.2 PCR 檢測(cè)

5 種處理和對(duì)照各取300 粒種子放入滅菌三角瓶中,加入30 mL 無(wú)菌雙蒸水,置于28 ℃下200 r∕min振蕩培養(yǎng)3 h,取1 μL 懸浮液作為PCR 模板。 選用特異引物BX-L1∕BX-S-R2(BX-L1:5’-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3’;BX-S-R2:5’-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3’)[9]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 每種處理3 個(gè)重復(fù)。 普通PCR 所需試劑均購(gòu)于天根生化技術(shù)有限公司。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):10 ×buffer 2.5 μL,MgCl22 mmol∕L,dNTPs 0.2 mmol∕L,Taq DNA 聚合酶1 U,正反向引物各0.2 μmol∕L,模板為1 μL 浸提液,無(wú)菌三蒸水補(bǔ)齊。 擴(kuò)增條件:95 ℃3 min;94 ℃35 s,60 ℃35 s,72 ℃45 s,35 個(gè)循環(huán); 72 ℃7 min。 PCR 儀為BIO-Rad T100TMThermal Cycler。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,Goldview 染液染色后,于紫外凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500)下觀察并拍照。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)

熒光染料為T(mén)akara 公司的SYBR green 定量PCR 染料,儀器為Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System,反應(yīng)體系按照Takara SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,擴(kuò)增程序采用Bio-Rad CFX 熒光定量PCR 儀默認(rèn)程序,即:95 ℃30 s;95 ℃5 s,60 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。 每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)重復(fù),以對(duì)照作為參比,采用相對(duì)定量(ΔCT 法)的方法計(jì)算出各處理與CK 的CT 值之差(ΔCT),以2-ΔCT計(jì)算所得的值即為各處理的相對(duì)帶菌量。

1.2.4 活菌分離檢測(cè)

取CK 和各處理種子的懸浮液100 μL,于KB 固體培養(yǎng)基上均勻涂板,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。 每處理設(shè)3 皿重復(fù)。

1.2.4.1 選擇性KB 平板的制備及涂板

選擇性KB 培養(yǎng)基:蛋白胨20 g∕L,丙三醇10 mL∕L,MgSO4·7H2O 1.5 g∕L,K2HPO41.5 g∕L,瓊脂15 g∕L,pH 調(diào)至7.0,121 ℃滅菌20 min,冷卻至50 ℃時(shí)加入氨芐青霉素20 mg∕L、新生霉素5 mg∕L、放線菌酮25 mg∕L。 取CK 和5 種處理種子的懸浮液100 μL,于選擇性KB 培養(yǎng)基上均勻涂板,置于28 ℃溫箱中恒溫倒置培養(yǎng)48 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4.2 總菌落DNA 提取及PCR 檢測(cè)用無(wú)菌水沖洗選擇性KB 培養(yǎng)基表面上分離培養(yǎng)的所有細(xì)菌菌落,離心濃縮,提取細(xì)菌的基因組DNA[16],并以此為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證。 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.2.2。

1.2.4.3 不同濃度細(xì)菌性果斑病菌懸浮液的制備及涂板

挑取細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株于液體KB 培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,離心收集菌體,1 mL 無(wú)菌水吹打至懸浮狀態(tài),根據(jù)OD600值分別配成2 ×104cfu∕mL、2 ×103cfu∕mL、2 ×102cfu∕mL 3 個(gè)濃度梯度,分別在選擇性KB 培養(yǎng)基和KB 培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板,每個(gè)濃度重復(fù)3 皿。 觀察選擇性KB 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌性果斑病菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.5 不同處理對(duì)種子發(fā)芽的影響

取CK 和不同處理種子各100 粒,浸泡12 h,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽24 h,統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、根長(zhǎng),以此判定各處理對(duì)種子發(fā)芽的影響,3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 與實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)

PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1):CK 和處理1—4 均可擴(kuò)增出特異性目的條帶(279 bp),但條帶亮度有所差異,其中CK 最亮,處理4(包衣處理)的條帶亮度最淡。 處理5(70 ℃高溫處理+包衣處理)未擴(kuò)增出目的條帶。

實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2):與CK 相比,處理1—4 的種子相對(duì)帶菌量均有不同程度的降低,且呈遞減趨勢(shì),處理4 的種子相對(duì)帶菌量降幅最為明顯;處理5 基本檢測(cè)不到帶菌。

上述結(jié)果表明:帶菌甜瓜種子經(jīng)5 種處理后,種子帶菌量均有所下降,其中以70 ℃高溫+包衣處理的殺菌效果最佳。

2.2 活菌分離檢測(cè)

2.2.1 KB 和選擇性KB 培養(yǎng)基的涂板及總菌落DNA 的PCR 檢測(cè)

不同處理的種子懸浮液在KB 培養(yǎng)基上涂板,經(jīng)28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后,各處理和CK 均有菌落長(zhǎng)出,其中以CK 長(zhǎng)出的菌落最為密集,處理1 次之;處理2—5 的菌落總數(shù)雖相對(duì)較少,但雜菌生長(zhǎng)旺盛(圖3A)。 由于雜菌量過(guò)多,且生長(zhǎng)速度較細(xì)菌性果斑病菌快,嚴(yán)重影響了總菌落DNA 的PCR 檢測(cè)結(jié)果,因此,選用優(yōu)化的選擇性KB 培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

選擇性KB 培養(yǎng)基的涂板結(jié)果表明(圖3B):只有CK 和處理1 有菌落長(zhǎng)出,處理2—5 均無(wú)菌落長(zhǎng)出。 提取CK 和處理1 的總菌落DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)表明(圖4):二者均能擴(kuò)增出目的條帶(279 bp)。

2.2.2 選擇性KB 培養(yǎng)基對(duì)果斑病菌生長(zhǎng)的影響

將細(xì)菌性果斑病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株懸浮液稀釋成2 ×104cfu∕mL 至2 ×102cfu∕mL 3 個(gè)10 倍濃度梯度,分別在KB 和選擇性KB 培養(yǎng)基上涂板,結(jié)果表明:細(xì)菌性果斑病病菌在KB 和選擇性KB 培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落生長(zhǎng)速度一致,數(shù)量相當(dāng),且菌落數(shù)目呈梯度變化,說(shuō)明選擇性KB 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長(zhǎng)無(wú)影響(圖5)。

2.3 不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表1 可知:處理3 對(duì)種子發(fā)芽率的影響較為明顯,發(fā)芽率僅為87%,CK 和其他4 種處理的發(fā)芽率均在90%以上。 處理1 和處理4 的種子平均根長(zhǎng)較CK 增長(zhǎng)顯著,處理5 與CK 無(wú)顯著差異,而處理2 和處理3 的種子根長(zhǎng)生長(zhǎng)卻受到明顯抑制。

表1 不同處理對(duì)種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of different treatments on seed germination

3 結(jié)論與討論

PCR 和實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果表明:除處理5 外,CK 和處理1—4 均能檢測(cè)到細(xì)菌性果斑病菌,但帶菌程度不同,帶菌量呈遞減趨勢(shì)。 用選擇性KB 培養(yǎng)基進(jìn)行涂板,可在很大程度上抑制雜菌的生長(zhǎng),但對(duì)細(xì)菌性果斑病菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 活菌分離試驗(yàn)表明,只有CK 和處理1 的種子上能分離到細(xì)菌性果斑病菌。 發(fā)芽試驗(yàn)表明,只有處理2 和處理3 對(duì)種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)有抑制作用。 綜合試驗(yàn)結(jié)果,處理5(70 ℃高溫+包衣)既不影響種子發(fā)芽,又可有效殺滅細(xì)菌性果斑病菌,效果最佳。

另外,雖然處理2—4 的種子PCR 和熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果均顯示陽(yáng)性,但均未分離到活的細(xì)菌性果斑病菌。 究其原因,可能是帶菌種子經(jīng)過(guò)這3 種方式處理后,其攜帶的細(xì)菌性果斑病菌已被殺滅,但仍存在不同程度的DNA 殘留,PCR 和熒光定量PCR 以殘留的DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增,所以呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。因此,在種子細(xì)菌性果斑病菌的檢驗(yàn)檢疫過(guò)程中,除了常規(guī)的PCR 檢測(cè)或者血清學(xué)檢測(cè)方法外,還應(yīng)進(jìn)行活菌分離或生長(zhǎng)法來(lái)檢測(cè)種子的帶菌情況,這樣檢測(cè)的結(jié)果才更加準(zhǔn)確可靠。