吳華莉,涂尾龍,曹建國,王洪洋,張鶯鶯,談永松

(上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海201106)

人ZFAND6 基因又稱AWP1(蛋白激酶C 相關(guān)激酶1 相關(guān)蛋白)基因。 有研究證實,AWP1 編碼208個氨基酸,在人的組織中廣泛表達,與腫瘤發(fā)生及細胞凋亡有關(guān)[1]。 鼠ZFAND6∕AWP1 具有ZnF-A20 和ZnF-AN1 兩種鋅指結(jié)構(gòu)域,A20 是一類Cys∕Cys2 類型鋅指結(jié)構(gòu),在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 信號通路中發(fā)揮重要作用[2]。 有研究證實具有鋅指結(jié)構(gòu)的民豬ZFAND5 基因cDNA 已被克隆出來,并且第4 外顯子存在突變位點,但關(guān)于其功能研究未見報道[3]。 目前,在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,網(wǎng)址https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gene∕? term=ZFAND6)已有人、鼠、牛、狗和雞等ZFAND6 基因的電子克隆序列,但有關(guān)ZFAND6 基因如何參與動物機體的功能研究以及豬ZFAND6 基因序列克隆、編碼蛋白質(zhì)功能未見報道。臍疝是豬生長發(fā)育中最常見的疾病之一,其發(fā)病率一般在0.13%—5%。 臍疝是指腹腔內(nèi)容物(主要脫出腹腔臟器為小腸與網(wǎng)膜)由臍部薄弱缺損部位突出于腹外[4]。 患臍疝的豬不僅生長緩慢,脫出臍孔的臟器還會引起感染,從而損害豬的使用性能,影響豬的銷售。 引起豬臍疝發(fā)生的原因復雜,有的是先天性的遺傳缺陷,如豬出生前臍孔發(fā)育不全或者腹壁閉合不完全;有的是后天環(huán)境造成的,如斷臍不當,引起臍孔損傷。 遺傳因素在其發(fā)病機制中具有重要作用[5-6]。 丁能水等[7]用覆蓋豬基因組范圍內(nèi)的194 個微衛(wèi)星標記對白色杜洛克×二花臉F2臍病資源家系進行基因型掃描和全基因組關(guān)聯(lián)分析,在1 號、2 號、7 號和10 號染色體共同檢測到與豬臍病相關(guān)聯(lián)的微衛(wèi)星標記,7 號染色體上的SWR1928 標記區(qū)域顯示與臍疝的顯著易感相關(guān)性。 吳麗花等[8]對F2∕F3臍病核心資源群體SWR1928 附近的39 個SNPs 進行基因分型,采用傳遞不平衡檢驗(Transmission disequilibrium test,TDT)分析方法進行檢測,結(jié)果表明:ZFAND6、EFTUDI和TGFβ3 基因的共7 個多態(tài)位點與臍疝呈顯著相關(guān)。 本試驗以‘申農(nóng)豬’為研究材料,擬擴增豬ZFAND6 編碼區(qū)序列,并對ZFAND6 基因在‘杜洛克豬’‘長白豬’‘大白豬’‘梅山豬’和‘申農(nóng)豬’群體中的SNP 位點進行篩選,以期為揭示豬ZFAND6 基因的遺傳特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取來自上海富民農(nóng)場的‘申農(nóng)豬’,屠宰后迅速取其肝臟組織,放置于RNA 組織保存液中帶回實驗室,-70 ℃保存?zhèn)溆?采集肝臟組織用于提取RNA,克隆豬ZFAND6 基因編碼區(qū)序列。 用于基因SNP 位點篩選的群體包括‘杜洛克豬’(100 頭)、‘大白豬’(150 頭)和‘長白豬’(80 頭),共計330 頭,來自上海祥欣畜禽有限公司。 ‘梅山豬’(110 頭)來自于上海狀元豬場;‘申農(nóng)豬’(70 頭)來自上海富民農(nóng)場。 采集豬耳組織塊用于提取總DNA,檢測豬ZFAND6 基因g.2395C ＞T 位點和g.15060A ＞G 位點的多態(tài)性。采集后耳組織塊放置于預先加入75%酒精的1.5 mL Eppendorf 管中,保存在冰盒中,運回實驗室,放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及耗材

組織RNA 提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 管、凍存管和瓊脂糖等試劑耗材均購于上海生工生物工程股份有限公司;TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T 克隆載體試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳檢測所用2000 bp Ladder DNA marker 購于大連寶生物工程有限公司;2 ×Taq PCR Master Mix 購于北京康為生物技術(shù)公司;限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和MboⅠ購于美國Fermentas 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬肝臟組織總RNA 提取及RT-PCR 反應

選取上海富民農(nóng)場‘申農(nóng)豬’的肝臟組織,采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提取組織中的總RNA,去除基因組中殘留的DNA,采用紫外分光光度計與1.5%瓊脂糖凝膠電泳兩種方法檢測總RNA 的濃度和質(zhì)量。 按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行總RNA 反轉(zhuǎn)錄試驗,合成的cDNA 放置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank(https:∕∕www. ncbi. nlm. nih. gov∕)網(wǎng)站公布的豬ZFAND6 基因電子克隆序列,利用Primer 3.0 在線軟件設(shè)計2 對引物,分別為ZFAND6-1F、ZFAND6-1R 和ZFAND6-2F、ZFAND6-2R,用于基因編碼區(qū)擴增;用于SNP 位點檢測的2 對引物分別為ZFAND6-3F、ZFAND6-3R 和ZFAND6-4F、ZFAND6-4R[9](表1)。 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 用于檢測ZFAND6 基因編碼區(qū)的引物和SNP 檢測引物Table 1 Primers for detecting coding region of ZFAND6 gene and SNP detection primers

1.3.3 PCR 擴增體系及反應條件

采用PCR 管配置反應體系(20 μL):2 ×Taq PCR Master Mix 11 μL,cDNA 模板0.8 μL,上下游引物各0.4 μL,RNase-Free ddH2O 7.4 μL。 PCR 反應條件:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35 個循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃冰箱保存。 PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存電泳圖片。

1.3.4 PCR 擴增目的片段TA 克隆與鑒定

采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR 擴增的目的片段,加入pMD20-T 克隆載體,置于16 ℃恒溫水浴鍋,反應時間為30 min,進行連接后轉(zhuǎn)化,將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布在瓊脂平板培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜,第二天形成單菌落。 挑取菌落,進行菌落PCR 鑒定,獲得與預期目的條帶大小一致的菌液,送上海生工生物工程股份有限公司測序,根據(jù)測序結(jié)果進行生物信息學分析。

1.3.5 生物信息學分析

使用NCBI 的ORF Finder 程序分析豬ZFAND6 基因開放閱讀框(ORF); ProtParam(http:∕∕web.expasy.org∕protparam∕)、Lasergene7.1 軟件包中的Editseq 軟件和Protean 軟件分析豬ZFAND6 蛋白的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì);PredictProtein(http:∕∕www. predictprotein. org)分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL(http:∕∕swissmodel.expasy.org∕)和PyMol 軟件分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu); PSORTII Prediction(http:∕∕psort.hgc.jp∕form.html)預測蛋白質(zhì)的亞細胞定位; Protfun(http:∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕ProtFun∕)在線軟件對豬ZFAND6 蛋白的功能進行預測分析;SMART(http:∕∕smart.embl-heidelberg.de∕)在線軟件分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域; Lasergene 7.1 軟件包中的MegAlign 軟件進行同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.3.6 PCR-RFLP 分析

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測,目的條帶單一明亮,進行酶切反應,酶切體系(16 μL):PCR 產(chǎn)物4 μL,10 ×Buffer 2 μL,HaeⅢ(MboI)0.5 μL,ddH2O 9.5 μL,反應時間為15 min 左右。

等位基因頻率和基因型頻率計算依據(jù)群體遺傳學計算公式。 A 基因頻率=(2AA+Aa)∕2(AA+Aa +aa) ×100%;a 基因頻率=(2aa+Aa)∕2(AA+Aa +aa) ×100%;基因型頻率=基因型個體數(shù)∕總個體數(shù)×100%。 A 和a 表示等位基因。 等位基因指位于一對同源染色體的相同位置上控制著相對性狀的一對基因。 本試驗中g(shù).2395C ＞T 位點等位基因為C 和T,g.15060A ＞G 位點等位基因為A 和G。 若成對的等位基因中兩個成員完全相同,則為純合子;若兩個等位基因各不相同,則為雜合子。 g.2395C ＞T 位點純合子為CC 和TT,雜合子為CT;g.15060A ＞G 位點純合子為AA 和GG,雜合子為AG。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肝臟組織提取總RNA 檢測

采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測豬肝臟組織總RNA的完整性(圖1),并測得其A260∕A280 比值在1.8—2.0,表明RNA 完整性較好,未發(fā)生降解,且無蛋白和DNA 污染;測得其質(zhì)量濃度為86 ng∕μL,符合RT-PCR 反應的要求。

2.2 豬ZFAND6 基因PCR 擴增CDS 區(qū)檢測和RFLR-PCR 結(jié)果檢測

豬ZFAND6 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,分別獲得629 bp 和991 bp 兩條明亮的條帶,與預期大小一致(圖2)。 將目的條帶進行切膠回收,連接pMD20-T 克隆載體,將克隆后的陽性菌液送公司測序,最終獲得豬ZFAND6 基因CDS 區(qū)序列。

ZFAND6-3F、FAND6-3R 引物擴增內(nèi)含子g.2395C ＞T 存在HaeⅢ酶切位點,分為TT(462 bp)、CT(462 bp、324 bp、138 bp)和CC(324 bp、138 bp)3 種基因型。ZFAND6-4F、ZFAND6-4R 引物擴增3’UTR區(qū)域g.15060A ＞G 存在MboⅠ酶切位點,分為AA(244 bp、218 bp)、AG(244 bp、218 bp、144 bp、100 bp)和GG(218 bp、144 bp、100 bp)3 種基因型(圖3)。

2.3 豬ZFAND6 基因CDS 區(qū)核苷酸序列及編碼氨基酸序列分析

登錄NCBI(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕)網(wǎng)站,尋找到DNA 的Open Reading Frame Finder 程序分析(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih. gov∕orffinder∕)網(wǎng)址,提交豬ZFAND6 基因序列,并參照Kozak 法則進行分析,結(jié)果顯示:ORF 的長度為624 bp,起始密碼子AGA 位于163 bp 處,終止密碼子TGA 位于729 bp 處,表明豬ZFAND6 基因CDS 區(qū)全長624 bp。 軟件分析其堿基組成分別為A 含量31.45%、T 含量29.44%、G 含量20.05%、C 含量19.05%,共編碼208 個氨基酸(圖4)。 (A+T)含量為61%,高于(G+C)39%的含量。

2.4 豬ZFAND6 蛋白的理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)包括分子量、氨基酸組成比例、理論等電點及蛋白質(zhì)的疏水性等[10]。 用ProtParam與Protean 軟件預測豬ZFAND6 蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示:豬ZFAND6 蛋白由208 個氨基酸殘基組成,分子式C950H1530N280O327S15,分子量22 587.1 u,理論等電點(pI)為6.87,說明該蛋白為酸性蛋白質(zhì)。 氨基酸殘基中Ser(15.38%)、Val(8.17%)和Gln(7.21%)的頻率較高,不穩(wěn)定系數(shù)為54.08,屬于不穩(wěn)定類蛋白質(zhì),預計在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)的半衰期為30 h。 疏水指數(shù)為58.51,平均親水性為-0.680,屬于可溶性蛋白。

2.5 豬ZFAND6 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

組成蛋白質(zhì)的氨基酸通過肽鍵相互連接構(gòu)成的一級結(jié)構(gòu)在空間發(fā)生折疊時,就形成蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[11]。 使用PredictProtein 軟件預測豬ZFAND6 蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果表明:豬ZFAND6 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β 折疊和無規(guī)卷曲3 種常見類型構(gòu)成。 采用SWISS-MODEL 和PyMol 軟件對豬ZFAND6 蛋白建模獲得三級結(jié)構(gòu)模型(圖5),表明豬ZFAND6 蛋白的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致。

2.6 豬ZFAND6 亞細胞定位和蛋白結(jié)構(gòu)域預測

豬ZFAND6 蛋白的亞細胞定位預測分析結(jié)果顯示:豬ZFAND6 蛋白在細胞質(zhì)分布較多,占65%,在線粒體和溶菌體分布較少,均為10%,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)分布比例為15%,但在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的比例不確定。 利用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)保守域分析軟件發(fā)現(xiàn),豬ZFAND6 蛋白具有ZnFA20 結(jié)構(gòu)域和ZnF-AN1 結(jié)構(gòu)域(圖6)。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預測表明:ZnF-A20 結(jié)構(gòu)域位于氨基酸11—35 位置區(qū)域,ZnF-AN1 結(jié)構(gòu)域位于氨基酸149—186 位置區(qū)域。

2.7 豬ZFAND6 蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MegAlign 軟件對豬、原雞、家鼠、人等物種的ZFAND6 蛋白氨基酸序列進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖7),結(jié)果表明:豬ZFAND6 蛋白氨基酸序列與牛、羊在系統(tǒng)進化樹中距離最近;ZFAND6 蛋白進化樹與生物進化的物種樹基本一致,符合物種進化規(guī)律,說明ZFAND6 基因編碼區(qū)在物種間比較保守。

2.8 g.2395C ＞T 位點在5 個豬群體的基因型和基因頻率統(tǒng)計

ZFAND6-3F、ZFAND6-3R 引物擴增內(nèi)含子g.2395C ＞T 的HaeⅢ酶切位點在5 個豬群體的檢測結(jié)果顯示:除了‘長白豬’群體未檢出TT 型和‘梅山豬’群體未檢測出CC 型外,其他4 個豬群體均檢出3 種基因型。 ‘杜洛克豬’和‘梅山豬’群體中CT 型比例較高。 ‘長白豬’‘大白豬’和‘申農(nóng)豬’群體中CC 型比例較高,基因型頻率分別為0.97、0.76 和0.72。

表2 g.2395C ＞T 位點在5 個豬群體中的基因型和基因頻率統(tǒng)計Table 2 Genotype and gene frequency of g.2395C ＞T locus in 5 pig populations

2.9 g.15060A ＞G 位點在5 個豬群體的基因型和基因頻率統(tǒng)計

引物擴增3’UTR 區(qū)域g.15060A ＞G 的MboI 酶切位點在5 個豬群體的檢測結(jié)果顯示:除了‘長白豬’群體未檢出GG 型外,其他4 個豬群體均檢出3 種基因型。 ‘杜洛克豬’和‘梅山豬’群體中AG 型比例較高。 ‘長白豬’‘大白豬’和‘申農(nóng)豬’群體中AA 型比例較高,基因型頻率分別為0.99、0.84 和0.80。

表3 g.15060A ＞G 位點基因在5 個豬群體中的基因型和基因頻率統(tǒng)計Table 3 Genotype and gene frequency of g.15060A ＞G locus in 5 pig populations

3 討論

本試驗首次采用RT-PCR、基因克隆以及核酸測序技術(shù)獲得了豬ZFAND6 基因CDS 區(qū)核苷酸序列,并采用生物信息學方法對豬ZFAND6 基因編碼的蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域進行預測分析。 由于大多數(shù)蛋白在折疊成天然結(jié)構(gòu)時才具有生物活性,因而對豬ZFAND6 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預測可為研究其生物功能提供依據(jù)。 結(jié)構(gòu)域預測顯示,豬ZFAND6 蛋白具有ZnF-A20 和ZnF-AN1 結(jié)構(gòu)域。 有研究證實在原核生物和真菌中,N’端的ZnF-A20 結(jié)構(gòu)域和C’端ZnF-AN1 結(jié)構(gòu)域兩者可單獨存在或者都存在,但在動物體中2個結(jié)構(gòu)域多數(shù)同時存在[12]。 A20 結(jié)構(gòu)域需要結(jié)合Zn2+才能形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。 有關(guān)研究資料報道證實,A20 結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)白介素細胞1(IL-1)誘導NF-κB 激活,從而產(chǎn)生對促炎癥因子TNFα 的免疫應答[2,13]。A20 結(jié)構(gòu)域的基因突變與炎癥反應、自身免疫應答和惡性病有關(guān)[14]。 AN1 結(jié)構(gòu)域包含有6 個保守半胱氨酸和組氨酸,可以潛在結(jié)合Zn2+[15]。

蛋白質(zhì)同源性的高低在一定程度上反映不同物種間親緣關(guān)系的遠近。 豬ZFAND6 蛋白與普通牛、羊、家犬、猴、黑猩猩及人等的氨基酸同源性在95%—97%,表明豬ZFAND6 蛋白與這些物種有較近的親緣關(guān)系,并且ZFAND6 基因編碼區(qū)在不同的物種長期生物進化過程中具有較強的保守性,未發(fā)生較大的變異。 人AWP1 可以激活核因子NF-κB,該因子在生物體內(nèi)的作用是組織損傷、應激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞功能[14]。 根據(jù)ZFAND6 基因編碼區(qū)在不同物種間保守的特性,推測豬ZFAND6 蛋白有可能也參與機體免疫應答反應。

目前有關(guān)豬臍病發(fā)病的分子遺傳機理研究進展有限,僅定位到一些易感區(qū)域,并未鑒別到可供育種選擇的分子標記或易感基因。 本試驗檢測豬ZFAND6 基因g.2395C ＞T 位點的T 等位基因頻率在‘長白豬’‘大白豬’和‘申農(nóng)豬’群體中頻率較低,而在‘杜洛克豬’和‘梅山豬’群體中頻率分別為0.61 和0.68,說明豬ZFAND6 基因g.2395C ＞T 在位點不同豬群體中遺傳特性不同。 呂顯山[5]對資源家系患臍疝病豬檢測結(jié)果顯示,g.15060A ＞G 位點GG 型為不利基因型。 本試驗在‘長白豬’群體內(nèi)未檢出g.15060A ＞G位點不利基因型GG 型,并且GG 型在‘杜洛克豬’‘大白豬’‘申農(nóng)豬’和‘梅山豬’群體中的比例較低。 這一結(jié)果暗示5 個豬群體中GG 不利基因型有被逐漸淘汰的趨勢。ZFAND6 基因的g.2395C ＞T 位點和g.15060A ＞G 位點檢測結(jié)果都表明該基因多態(tài)位點在5 個豬群體中表現(xiàn)出不同的遺傳特點。 接下來的研究可根據(jù)ZFAND6 基因型在不同豬種群的基因型頻率變化,利用這些遺傳標記結(jié)合患臍疝豬個體和健康豬進行疾病的相關(guān)性分析,從而為規(guī)模化、現(xiàn)代化的養(yǎng)豬場降低臍病發(fā)病率提供理論依據(jù)。 此外,臍疝多見于小公豬,發(fā)生的原因與近親繁殖有關(guān)[16],豬場應避免近親交配。 有學者研究遺傳性大鼠臍疝模型時發(fā)現(xiàn),隨著近交系數(shù)的增大,大鼠臍疝率升高[17]。 因此,有臍疝或臍疝家族史的公母豬不得留種,早期淘汰相關(guān)的有害基因,這可在一定程度上降低豬群臍疝的發(fā)生率。