呂文遠,張麗勍,高清華,段 可*

(1 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306;2 上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所,上海201403)

草莓果實中的可溶性糖主要有3 種:蔗糖、葡萄糖、果糖,其中果糖甜度最高,‘紅顏’草莓果實中果糖含量相對較高[1]。 植物光合作用主要產(chǎn)物是蔗糖,蔗糖和尿苷-5’-二磷酸二鈉鹽(UDP)在蔗糖合酶(Sucrose Synthase,SS,EC2.4.1.13)的作用下水解為果糖和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG),該過程是可逆的[2]。 果糖在果糖激酶(Fructokinase,FRK,EC2.7.1.4)的作用下進一步磷酸化生成6-磷酸果糖。 己糖激酶(Hexokinase,HK,EC 2.7.1.1)主要磷酸化葡萄糖,果糖激酶主要磷酸化果糖[3],FRK 在果糖代謝過程中具有十分重要的作用。 已知的FRKs 是碳水化合物嘌呤激酶家族的成員,被稱為磷酸果糖激酶B(pfkB)家族[4],該家族與植物中的果糖代謝合成途徑密切相關。 對FRK基因表達的研究有助于揭示植物中果糖的代謝與合成。

馬鈴薯[5]、鱷梨[6]、大麥[7]、豌豆[8-9]、水稻[10]和柑橘[11]等作物中的FRK基因均已被分離出來。 甘蔗中有7 個與果糖激酶相關的基因(ScFRK1—ScFRK7),其中ScFRK1 和ScFRK5 是主效基因,ScFRK1 基因表達量最高,ScFRK5 基因次之,ScFRK4 基因在赤霉素的脅迫下表達量明顯上升[12]。 在擬南芥中,果糖激酶AtFEK1 和AtFRK2 基因對果糖具有較高特異性[13]。 在日本梨果實中,隨著果糖含量的增加,果糖激酶的活性會持續(xù)下降[14]。 Qin 等[15]在枇杷中分離出果糖激酶EjFRK基因,通過動態(tài)監(jiān)測EjFRK基因轉錄本和FRK 酶活性的變化,發(fā)現(xiàn)EjFRK基因在果實發(fā)育早期的表達水平較高,成熟期表達水平較低,與FRK 酶活性的變化趨勢相似,而FRK 酶活性的變化與果實發(fā)育進程方向相反,高FRK 酶活性不利于枇杷果實果糖積累。 趙建華等[16]從‘寧杞1 號’枸杞果實中分離得到LbFRK7 基因,發(fā)現(xiàn)該基因在枸杞果實的發(fā)育過程中對果糖轉化具有一定的作用,特別是在果實成熟過程中對果糖含量的升高具有重要作用。Yang 等[17]研究發(fā)現(xiàn),蘋果的莖尖和幼果中,MdFRK2 基因的表達非常高。 草莓果實糖分積累研究較多,但有關草莓果實甜度控制重要的果糖代謝和果糖激酶基因的研究尚未見報道。 本試驗以‘紅顏’草莓果實為材料,克隆和分離獲得草莓果實中FaFRK3 基因的cDNA 全長序列,并對‘紅顏’植株不同器官以及草莓果實發(fā)育各個時期的FaFRK3 基因的表達進行分析,以期為后續(xù)基因功能分析和果實甜度遺傳控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及試劑

選取2017 年10 月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行試驗站塑料大棚中生長狀況良好的草莓品種‘紅顏’(Fragaria×ananassaDuchesne ‘Benihoppe’)為試驗材料,分別選取綠果期(G,果實綠色,瘦果緊密聚合)、白果期(W,果實白色膨大,瘦果不再緊密聚合)、轉色期(T,果實著色面積達25%—50%)、成熟期(R,果實完全著色成熟)4 個發(fā)育階段的草莓果實,以及‘紅顏’植株的根、短縮莖、葉、花、種子5 個器官。每個時期的果實設置3 次生物學重復,隨機選取同一時期的10 個果實混為一組,共3 組進行液氮磨樣,存放于-80 ℃冰箱中備用。

所用載體為入門載體pDONR221,大腸桿菌TOP10 和根癌農(nóng)桿菌GV3101 購于上海唯地生物技術有限公司,質粒小抽試劑盒和DNA 純化試劑盒購于天根生化科技有限公司,植物RNA 提取試劑盒為E.Z.N.A Plant RNA Kit(美國OMEGA 公司),SYBR GreenⅠ熒光染料購于上海生工生物工程股份有限公司,反轉錄試劑盒購于大連TaKaRa 公司,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1FaFRK3 基因全長cDNA 的克隆

利用E.Z.N.A.Plant RNA 試劑盒從‘紅顏’草莓果實中提取RNA,利用Oligo 軟件進行FaFRK3 基因CDS 引物(FaFRK3-F 和FaFRK3-R)設計(表1),使用MLV 反轉錄酶、RNase Inhibitor 進行反轉錄,得到單鏈cDNA。 PCR 反應體系為:25 μL 2 ×Es Taq MasterMix(Dye),上下游引物各2 μL,1 μL cDNA,加水至50 μL 體系。 PCR 反應程序:98 ℃預變性5 min;98 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共30個循環(huán),72 ℃延伸5 min。 擴增后的PCR 產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收得到FaFRK3 基因的目的片段,連接到pDONR221 入門載體上[18],重組載體轉入TOP10 大腸桿菌感受態(tài)細胞中,菌液檢測呈陽性的單克隆送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.2 生物信息學分析

通過Pfam 分析得到果糖激酶保守結構域pfkB(PF00294.24)氨基酸序列,將該序列在GDR(https:∕∕www.rosaceae.org∕)中進行BLAST 分析,得到草莓中基因序列mrna07897.1-v1.0-hybrid。 BLAST 分析表明,該基因序列與FRK3 基因一致性最高,因此將其命名為FaFRK3。 使用MEGA5 構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹,bootstrap 重復次數(shù)為1 000 次(圖2)。 利用ProtParam(http:∕∕web.expaasy.org∕protparam∕)對FaFRK3 蛋白進行蛋白質性質分析,通過DNAMAN 進行序列相似性分析,利用HMMER(http:∕∕www.hmmer.org∕)對基因序列結構域和功能進行分析,利用ProtScale(http:∕∕web. expasy. org∕protscale∕)對FaFRK3 蛋白進行親疏水性分析。

1.2.3 FaFRK3 基因表達分析

使用Oligo 軟件進行實時熒光定量分析引物(FaFRK3-RT-F、FaFRK3-RT-R)設計(表1),內(nèi)參引物為EF1α。 參照呂文遠等[19]定量方法對FaFRK3 基因進行實時熒光定量分析,3 次生物學重復。 采用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 ‘紅顏’草莓FaFRK3 基因克隆分析

利用Oligo 軟件設計的引物(FaFRK3-F∕R)進行PCR 擴增,獲得目的基因(圖1),FaFRK3 基因含有一個1 158 bp 的開放閱讀框(ORF),編碼有386 個氨基酸,其編碼蛋白理論等電點和相對分子質量分別為5.04 和94 292.57 ku,FaFRK3 蛋白分子式為C3757H6241N1275O1611S270,脂肪酸系數(shù)為20.47,不穩(wěn)定系數(shù)為39.46,是一個穩(wěn)定的蛋白,屬于pfkB 糖激酶家族。 通過DNAMAN 進行序列比對顯示,其與FRK 蛋白氨基酸序列相似性較高,其中與月季的FRK 蛋白氨基酸序列相似性最高(圖2)。

2.2 FaFRK3 蛋白結構分析

對測序所得基因序列結構域和功能進行分析,利用SignalP 工具進行信號肽預測顯示,該基因含有一個信號肽,位置為1—27 堿基,分值為0.450(圖3)。 利用ProtScale 進行親疏水性分析表明,FaFRK3 蛋白大部分氨基酸屬于疏水性氨基酸(圖4),說明蛋白質結構穩(wěn)定。

2.3 FaFRK3 基因定量表達分析

由定量分析結果可以看出,FaFRK3 基因在‘紅顏’草莓莖中的相對表達量最低,在種子中的相對表達量最高(圖5)。FaFRK3 基因在‘紅顏’草莓果實綠果期表達量最高,隨后逐漸降低,成熟期FaFRK3 基因表達量最低(圖6)。

3 結論與討論

植物中的FRK基因對植物的果糖積累具有明顯的影響。 草莓果實中的FaFRK3 蛋白氨基酸序列與月季(Rosachinensis,XP_024157436.1)中的氨基酸序列相似率高達90.16%,與水蜜桃(Prunus persica,XP_007205340.1)、棗(Ziziphus jujuba,XP_015873836.1)、番木瓜(Carica papaya,XP_021909927.1)、克里曼丁橘(Citrus clementina,XP_006425063.1)等植物也高度同源。 氨基酸序列比對分析表明,FaFRK3 蛋白具有pfkB 糖激酶家族的明顯特征,屬于pfkB 糖激酶家族,提示FaFRK3 基因是‘紅顏’草莓果實中果糖激酶蛋白的關鍵編碼基因之一。 定量表達分析發(fā)現(xiàn),FaFRK3 基因在‘紅顏’草莓果實不同發(fā)育時期的表達量差別較大,并且在不同器官中相對表達量明顯不同。 隨著‘紅顏’草莓果實的成熟,FaFRK3 基因的相對表達量明顯減少,這與枸杞中的LbFRK7 基因[16]和楊梅中的MrFRK2 基因[20]表達趨勢分析結果一致。