陳敏敏,張永春*,蔡友銘,楊柳燕,聶功平

(1 上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403;2長江大學園藝園林學院,荊州434025)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬重要的球根花卉,廣泛分布于北半球寒帶與溫帶地區(qū)。 目前世界范圍內已知的野生百合超過100 種,已注冊的商業(yè)品種則超過上萬種[1],百合園藝新品種更新速度快,開展新優(yōu)品種自主選育對我國百合產業(yè)的發(fā)展至關重要,然而,商業(yè)品種一般雜合度高、遺傳背景復雜,不同種系內與種系間開展雜交育種工作較為盲目,因此,開展遺傳倍性鑒定對雜交育種工作尤為重要。

根據英國皇家園藝學會與北美百合學會制定的分類系統(tǒng),百合主要分為亞洲百合雜種系(Asiatic hybrids,A)、東方百合雜種系(Oriental hybrids,O)、麝香百合雜種系(Longiflorum,L)、喇叭形和奧瑞蓮雜種系(Trumpet and Aurelian Hybrids,T)、歐洲百合雜種系(Martagon Hybrids)、美洲百合雜種系(American Hybrids)、純白百合雜種系(Candidum Hybrids)、其他種間雜交產生的雜種系(包括LA、LO、OT、OA、OL)等。 種內雜交一般產生AA、LL、OO、TT 等二倍體品種群,但也容易產生三倍體品種群,如鐵炮系(LLL)、亞洲系(AAA)、東方系(OOO)等[2]。 種間雜交容易產生三倍體,如三倍體LAA 或ALA 雜交后代是鐵炮系(L)、亞洲系(A)雜交后代(LA)與亞洲系(A)回交的結果;東方系(O)與喇叭系(T)的雜交后代(OT)作為父本或母本與東方系(O)回交產生OOT 或OTO[3]。

百合倍性相關研究表明,除卷丹為三倍體外,大部分野生百合為二倍體[4];組間雜種多為三倍體、四倍體和一些非整倍體[5]。 李克虎等[4]采用染色體常規(guī)制片技術對45 個百合品種進行倍性分析,發(fā)現組內雜交品種大部分為二倍體,組間雜交品種大部分為三倍體。 周桂雪等[6]報道組內品種群如東方百合和麝香百合一般為二倍體,而組間品種多為三倍體。 Marasek-Ciolakowska 等[5]也報道三倍體LAA(ALA)和OOT(OTO)雜交種在百合品種中占很大比例。

流式細胞術(FCM)是20 世紀80 年代興起的一項新技術,能簡單、快速的檢測植物的倍性,已被用于多種植物育種及倍性的鑒定中[7-10]。 本研究擬針對部分百合園藝新品種倍性不詳的情況,采用本實驗室前期建立的流式細胞儀倍性鑒定方法開展倍性快速鑒定[11],旨在為品種資源的高效利用與育種效率的提高奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

61 個代表性百合主栽品種均引自荷蘭,包括19 個亞洲百合品種、16 個東方百合品種、15 個LA 雜交品種、9 個OT 雜交品種和2 個Martagon 系雜交品種。 二倍體對照材料為索邦(‘Sorbonne’,2n=2x=24),三倍體對照材料為木門(‘Conca d’or’,2n=3x=36)。

1.2 流式細胞儀倍性鑒定

取新鮮待測植物葉片0.1—0.15 g,放置于直徑為6 cm 的培養(yǎng)皿中,加入1.0—1.5 mL Kiwifruit Buffer裂解液,同時用鋒利刀片一次性快速切碎葉片至糊狀(確保整個過程中材料浸沒在解離液里,以便更好地游離細胞核),提取時間60 s;將培養(yǎng)皿中的液體用30 μm 濾網過濾到1.5 mL 離心管中,濾液保持在1.0 mL左右,置于4 ℃冰箱5 min。 取出樣品,4 ℃下1 000 r∕min 離心5 min,棄上清,加入600 μL 解離液與60 μL 預冷PI 染色液于4 ℃避光染色15 min,處理結束后上機測試,所用儀器為BeckmanColour 流式細胞儀。 采用Excel 2010 軟件進行數據處理。

2 結果與分析

被檢測的61 個百合品種可以分為5 類,包括亞洲百合(A)、東方百合(O)、LA、OT、Martagon 系,對不同種系的倍性情況進行統(tǒng)計分析,結果表明:19 個亞洲百合品種中,16 個(‘Heartstrings’‘White Twinkle’‘Trendy Savannah’‘Fata Morgana’‘Matrix’‘Trendy Havana’‘Golden Matrix’‘Tribal Dance 600’‘Trendy Dakota’‘Tiny Padhye’‘Tiny Bee’‘Tiny Rocket’‘Tiny Invader’‘Tiny Double You’‘Tiny Pearl’‘Levi’)為二倍體(2n =2x =24),1 個品種(‘Lancifolium Flore Pleno’)為三倍體(2n =3x =36),2 個品種(‘Pink Flight’‘Pearl Frances’)為四倍體(2n=4x =48)(圖1),種內雜交的亞洲百合大部分為二倍體,占所有測定品種的23.26%。

16 個東方百合品種中,15 個品種(‘Roselily Elena’‘After Eight’‘Sheer Blonde’‘Sunny Martinique’‘Sunny Keys’‘Marlon’‘Roselily Monica’‘Roselily Natalia’‘Reeleeze’‘Roselily Samantha’‘Souvenir’‘Roselily Thalita’‘Sunny Azores’‘Roselily Isabella’‘Entertainer’)為二倍體(2n =2x =24)。 1 個品種(‘Viviana’)出現二倍體非整倍體現象(圖2),種內雜交的東方百合大部分為二倍體,占所有測定品種的24.59%。

15 個LA 品種中,11 個品種(‘Albufeira’ ‘Armandale’ ‘Beau Soleil’ ‘Golden Stone’、‘Merlet’‘Flamington’‘Nashville’‘Bonsoir’‘Royal Sunset’‘Eyeliner’‘Indian Summerset’)為三倍體(2n=3x =36),1 個品種(‘Honesty’)為四倍體(2n=4x=48)。 3 個品種(‘Bach’‘Fangio’‘Mynnou’)出現三倍體非整倍化現象。 種間雜交的LA 品種大部分為三倍體,15 個LA 品種中11 個為三倍體,占測定品種的18.03%(圖3)。

9 個OT 品種中,1 個品種(‘Black Beauty’)為二倍體(2n=2x=24),5 個品種(‘Touchstone’‘Palazzo’‘Manissa’‘Profundo’‘Competition’)為三倍體(2n=3x=36),2 個品種(‘Passion Moon’‘White Eyes’)為四倍體(2n=4x=48)。 1 個品種(‘Zambesi’)出現三倍體非整倍化現象。 種間雜交的OT 品種大部分為三倍體,9 個OT 品種中5 個為三倍體,占測定品種的8.20%(圖3)。

2 個Martagon 品種中,1 個品種(‘Manitoba Morning’)為二倍體(2n =2x =24),1 個品種(‘Sunny Morning’)為三倍體(2n=3x=36)。

3 討論

我國野生百合資源豐富,幾大系中,亞洲百合(Asiatic hybrids)是由Sinomartagon 系(包括Lilium dauricum、Lilium lancifolium等)種內雜交形成[12]。 東方百合(Oriental hybrids)則是Archelirion 系種內雜交形成,鐵炮百合(Longiflorum hybrids)是Leucolirion 系種內雜交形成[13]。 本研究中不同種系品種鑒定結果表明,19 個亞洲百合中有16 個為二倍體,16 個東方百合有15 個為整二倍體,與李克虎等[4]、周桂雪等[6]、簡佳等[14]報道的大部分百合組內雜交品種為二倍體一致;19 個亞洲百合中有1 個三倍體,有2 個四倍體,這一結果與李克虎等[4]報道的切花亞洲百合多為二倍體,但也有部分三倍體和四倍體品種,與Zhou 等[2]報道的亞洲百合種內雜交也易產生三倍體結果一致。 15 個LA 百合有11 個為三倍體,9 個OT百合有5 個三倍體(圖3),與李克虎等[4]報道的組間雜交品種多為三倍體結果一致。

榮立蘋等[15]采用根尖壓片法對卷丹、毛百合、朝鮮百合、蘭州百合、大花卷丹、有斑百合、細葉百合、垂花百合的染色體數目進行了觀察研究,結果表明2%—10%二倍體種中出現了染色體數目的非整倍性變異,在部分百合中還觀察到B 染色體。 Khan 等[16]報道當二倍體LA 雜交種與親本亞洲百合后代回交時,會產生二倍體、三倍體和非整倍體(2x-1,2x+2,2x +3)雜交后代;Luo 等[17]報道三倍體OT 雜種(OOT)的BC2后代是非整倍體,其染色體數目從25 到29 不等;Xi 等[18]報道異源三倍體LO 雜交種(LLO)易產生非整倍體功能性雌性配子,從而造成所有的后代均為非整倍體。 因此,商品種會出現一定比例的非整倍體,本研究中也鑒定出1 個二倍體非整倍體品種和4 個三倍體非整倍體品種,包括了東方百合、LA 和OT 百合,說明不同種系均可能出現非整倍體。

不同倍性的百合材料雜交親和性不同,Johnston[19]提出Endosperm Balance Number(EBN)假說,認為在雜種胚乳中,只有當母本基因與父本基因比為2∶1時胚乳才可以正常發(fā)育,否則胚乳的發(fā)育會停滯。 向仕華等[20]報道以四倍體為母本的雜交組合種子萌發(fā)率遠高于以二倍體為母本的雜交組合;Barba-Gonzalez 等[21]報道以二倍體為母本與三倍體百合進行雜交能獲得子代,而以四倍體為母本、三倍體為父本時沒有獲得子代。 上述研究表明,不同倍性百合做親本時會顯著影響雜交子代,因此在親本選配前了解倍性有利于提高雜交效率。 另外,多倍體百合相較二倍體不僅觀賞性更佳、抗性更強,而且作為雜交親本有可能可以克服遠緣雜交的不育性[22]。

從Da Laat 等[23]首次采用流式細胞術檢測植物倍性水平以來,該方法已成為植物倍性鑒定的常用方法。 較傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定與染色體計數鑒定法,流式細胞儀鑒定法具有如下優(yōu)點:樣品制備程序簡單;檢測通量高,可在較短時間內快速檢測大量樣品;精準度高,每個樣品可收集大量細胞核進行檢測;同時,這種方法僅需少量植物材料,對植物破壞性小。 本研究采用本實驗室已建立的鑒定方法對61 個百合品種葉片材料進行快速倍性鑒定,獲得的結果可為花期不同種系間雜交組合的配制提供理論參考。 本研究發(fā)現以二倍體品種(‘Sorbonne’)或三倍體品種(‘Conca d’or’)為對照進行倍性檢測時,有5 個品種存在非整倍體現象(圖2、圖3),但流式細胞儀僅能檢測出其為非整倍體,無法確定其增加或缺失的染色體條數,仍需用染色體壓片或熒光原位雜交技術對這些品種進行進一步確定。